抗原-抗体反应的基本类型

抗原-抗体反应的基本类型_免疫学与免疫制剂

第二节　抗原-抗体反应的基本类型

根据抗原的性质、结合反应的现象、参与反应的成分等因素，可将基于抗原-抗体反应的检测方法分为凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应、中和反应以及免疫标记技术等。

一、凝集反应（agglutination）

细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物，此为凝集反应。

（一）直接凝集反应

细菌或红细胞与相应抗体直接反应，可出现细菌或红细胞凝集现象（图10-2）。

1.玻片法:定性

其方法为:①已知抗体与相应抗原在玻片上反应，用于抗原的定性检测（如ABO血型鉴定、细菌鉴定）。

图10-2　直接凝集反应示意图

2.试管法:定量

多用已知抗原测未知抗体的相对含量，如:诊断伤寒、副伤寒、布氏杆菌病。

方法:待检血清在试管内用0.9%氯化钠倍比稀释，加入等量菌液，37℃，数小时观察结果（表10-1）。

表10-1试管倍比稀释法测定待检血清效价

观察每个试管内抗原的凝集程度，凝集分五级:

（1）＋＋＋＋:很强，细菌全部凝集，管内液体澄清，可见管底有大片边缘不整的白色凝集物，轻摇时可见明显的颗粒、薄片或絮状。

（2）＋＋＋:强，细菌大部分凝集，液体较混浊，管底有边缘不整的白色凝集物，轻摇时也可见明显的颗粒、薄片或絮状。

（3）＋＋:中等强度，细菌部分凝集，液体较混浊，管底有少量凝集物呈颗粒状。

（4）＋:弱，细菌仅有少量凝集，液体混浊，管底凝集呈颗粒状，小不易观察。

（5）-:不凝集，液体混浊度、管底沉积物同对照管相似。

通常以出现明显凝集现象（＋＋）的血清最高稀释度为该血清的抗体效价。

（二）间接凝集反应

该反应将可溶性抗原包被在与免疫无关的载体颗粒表面，再与相应抗体反应，出现颗粒物凝集现象（图10-3）。常用载体为人O型血红细胞、聚苯乙烯乳胶颗粒等。用途:检测血清中的自身抗体和抗微生物的抗体。

图10-3　间接凝集反应示意图

（三）间接凝集抑制试验

其原理是:将待测抗原（或抗体）与特异性抗体（或抗原）先行混合并作用一定时间，再加入相应致敏载体悬液；若待测抗原与抗体对应，即发生中和，随后加入的相应致敏载体颗粒不再被凝集，使本应出现的凝集现象被抑制，故得名（图10-4）。此试验可用于检测抗原或抗体（如早孕的检测），其灵敏度高于一般间接凝集试验；可用来检测可溶性抗原，如免疫妊娠诊断试验。

（1）诊断抗原:HCG致敏的乳胶颗粒；

（2）诊断血清:抗HCG的抗体；

（3）检测标本:尿液（是否含有HCG）。

图10-4　间接凝集抑制反应示意图

（四）反向间接凝集试验

反向间接凝集试验是用特异性抗体致敏载体，检测标本中的相应抗原的反应（图10-5），可用于检测乙型肝炎病毒表面抗原、甲胎蛋白、新型隐球菌荚膜抗原等。

图10-5　反向间接凝集试验示意图

（五）协同凝集试验

协同凝集试验（COAG）的原理是:金黄色葡萄球菌细胞壁成分蛋白A（SPA）能与人和多种哺乳动物血清中的IgG分子的Fc片段结合，Fab就暴露，能与相应抗原结合，产生协同凝集反应（图10-6）。本试验通常可用于检测传染病患者的血液、脑脊液和其他分泌物中可能存在的微量可溶性抗原，目前已用于流行性脑脊髓膜炎（简称流脑）、伤寒、布氏菌病的早期诊断。

二、沉淀反应

沉淀反应（precipitation）是将可溶性抗原（沉淀原）与相应抗体（沉淀素）结合后，在一定条件下出现肉眼可见的沉淀，此为沉淀反应。该反应多用半固体琼脂凝胶作为介质进行琼脂扩散或免疫扩散，即可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散，在比例合适处相遇即形成可见的白色沉淀。

沉淀原:内、外毒素，菌体裂解液、血清、蛋白质、多糖、类脂等，其体积小，与抗体相比反应面积大，故试验时需对抗原进行稀释，以避免沉淀原过剩出现后带现象，并以抗原稀释度作为沉淀试验的效价。

（一）液相沉淀试验——环状沉淀试验

已知抗血清＋待检抗原→液面交界处，白色环状沉淀“＋”，可用来鉴别血迹性质、测定媒介昆虫的嗜血性、鉴定某些细菌。

图10-6　协同凝集试验示意图

（二）琼脂扩散试验

用半固体琼脂凝胶作为介质进行琼脂扩散或免疫扩散，即可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散，在比例合适处相遇即形成可见的白色沉淀。

1.双向免疫扩散

双向免疫扩散（double immunodiffusion）是将抗原和抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由向四周扩散，在相遇处形成沉淀线。若反应体系中含两种以上抗原-抗体系统，则小孔间可出现两条以上沉淀线（图10-7）。特点:敏感性不高，所需时间较长。用于:

（1）定性检测可溶性抗原或抗体。

（2）对复杂的抗原成分或抗原、抗体的提取纯度进行分析鉴定。

（3）测定免疫血清的效价。

图10-7　双向琼脂扩散试验示意图

2.单向免疫扩散

单向免疫扩散（single immunodiffusion）是将一定量已知抗体混于琼脂凝胶（45℃）中制成琼脂板，在适当位置打孔并加入抗原。抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心的沉淀环，环的直径与抗原含量呈正相关。取已知量抗原绘制标准曲线，可根据所形成沉淀环的直径，从标准曲线中查出待检标本的抗原含量（图10-8）。

图10-8　单向琼脂扩散试验示意图

3.对流免疫电泳

对流免疫电泳（CIE）又称免疫电渗电泳，双向琼脂扩散与电泳技术相结合。试验在装有pH8.6缓冲液的电泳槽中进行（图10-9）。

图10-9　对流免疫电泳试验示意图

（1）原理:抗原和抗体在电泳时受两种作用力的影响，一种是电场力，使抗原和抗体由“-”极向“＋”极移动；另一种是电渗力，使抗原和抗体由“＋”极向“-”极移动。

通常，抗原等电点偏低（pH 4～5），在碱性缓冲液（pH 8.6）中所带负电荷较多，受电场力较大，而其相对分子质量较小，所受电渗作用影响小，合力结果是电场力大于电渗力。因此，通电后，抗原由“-”极向“＋”极移动。

抗体为球蛋白，等电点偏高（pH 6～7），所带负电荷较少，受电场力影响较小，而其相对分子质量较大，所受电渗作用影响大，合力结果电渗力大于电场力。因此，通电后，抗体由“＋”极向“-”极移动。

两者相对而行，缩短了反应时间，提高了试验的敏感性。

（2）特点:操作简便，敏感性高，所需时间短。本试验可用来检测血清中的HBsAg和AFP等可溶性抗原。

（3）方法:将抗原和抗体分别加入琼脂板孔中，通电进行电泳［4m A/cm（宽）端电压:6V/cm］，电泳45～60min，水洗和洗色。

4.火箭电泳

火箭电泳又称电泳免疫扩散，单向琼脂扩散与电泳结合。本试验的敏感性与单向琼脂扩散相当，但所需时间短，故可用来测定标本中可溶性抗原的含量（图10-10）。

试验时，将适当浓度的已知抗体加入融化（45℃）的琼脂中，混匀后浇注于玻璃板，制成凝胶板，将抗原加入孔中，在盛有pH8.6缓冲液的电泳槽中电泳，电流强度3m A/cm（或电压10V/cm），电泳时间2～10h。电泳后在比例最适处形成锥形沉淀峰。

图10-10　火箭免疫电泳试验示意图

5.免疫电泳

免疫电泳（immunoelectrophoresis）是将琼脂电泳与双向琼脂扩散结合的技术。待检标本在孔内先电泳，各种成分分开。之后挖槽，加入相应抗体，进行双向琼脂扩散。

根据沉淀弧的数量、位置、形状，并通过与已知标准抗原相比，可对样品中所含成分及其性质作出判断（图10-11）。

本试验样品用量小、特异性高、分辨力强，主要用于血清蛋白及抗体成分的分析研究，亦可用于抗原或抗体提取物的纯度鉴定。

图10-11　免疫电泳试验示意图

三、补体参与反应

1.溶菌反应:细菌与相应抗体结合，可激活补体，使细菌溶解，主要发生于霍乱弧菌等G＋菌，可用于细菌鉴定。

2.溶血反应:红细胞与相应抗体结合，通过激活补体使红细胞溶解，可作为补体结合试验的指示系统。

3.补体结合反应:是一种在补体参与的条件下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统来测定有无相应抗原或抗体的血清学试验（图10-12）。

图10-12　补体结合反应示意图

四、中和试验

毒素、酶、激素和病毒等与相应抗体（中和抗体）结合，使之丧失生物学活性的现象称为中和反应。

1.病毒中和试验

病毒中和试验是病毒在活体内或细胞培养中被特异性抗体中和而失去感染性的一种试验。检查患病后或人工免疫后机体血清中相应中和抗体的增长情况，也可用来鉴定病毒。

2.毒素中和试验

外毒素与相应抗毒素结合后丧失其毒性，分体内和体外两种。

如:抗链球菌溶血素O试验。

乙型溶血性链球菌→溶血素（可溶解人、兔红细胞）→刺激机体产生抗毒素（抗体）。溶血素＋抗体→毒性丧失，不溶血。

病人血清（未知）＋溶血素O（经一定时间）＋人红细胞→红细胞不溶解破坏——待检血清中有相应抗体，试验“＋”。

本试验常用于临床风湿病的辅助诊断。

五、免疫标记技术

免疫标记技术（immunolabelling technique）是用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等标记抗体或抗原，进行抗原-抗体反应的检测。标记物与抗体或抗原连接后并不改变抗原-抗体的免疫特性，具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优点。

（一）免疫荧光法（immunofluorescence，IF）

免疫荧光法又称荧光抗体技术，用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原-抗体复合物散发荧光，借此对抗原进行定性或定位。

荧光素包括:异硫氰酸荧光素（FITC）（黄绿色荧光）、四乙基罗丹明（RB200）（橙色荧光）、四甲基异硫氰酸罗丹明（TM RITC）（橙红色荧光）。

1.直接荧光法:待检标本（固定在玻片上）＋已知荧光抗体→洗去游离的荧光抗体→干燥后，荧光显微镜下观察（图10-13）。

用途:病毒感染的细胞、携带某种特异性抗原的细胞的检测。

优点:方法简便、特异性高。

缺点:敏感性低，检测多种抗原需制备多种相应的荧光抗体标记。

图10-13　直接荧光法示意图

2.间接法（又称荧光-抗体法）

间接法是用来检测标本中未知的抗原，或检测血清中未知抗体（图10-14）。

（1）检测抗原。未标记抗体＋待检抗原（未知）→（冲洗）＋荧光标记抗抗体→冲洗、干燥、荧光显微镜下观察。

（2）检测抗体。待检血清（未知抗体）＋抗原标本（已知）→（冲洗）＋荧光标记抗抗体→冲洗、干燥、荧光显微镜下观察。

优点:敏感性高，制备一种荧光标记抗抗体即可对多种抗体-抗体系统进行检测。

缺点:易出现非特异性荧光。

图10-14　间接荧光法示意图

3.补体法

补体法的作用原理与间接法相似，只是抗原-抗体作用后，加入新鲜豚鼠血清（补体），通过激活补体形成抗原-抗体-补体（C3b）复合物，再用荧光素标记的抗C3b抗体染色，使上述复合物发出荧光（图10-15）。

图10-15　补体法示意图

（二）酶免疫测定（enzyme immunoassay，EIA）

将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，借助酶作用于底物的显色反应判定结果，用酶标测定仪做定性或定量分析。优点:敏感性高，特异性强，可定性、定量。

标记酶:

（1）辣根过氧化物酶（HRP）

底物:邻苯二胺（OPD）（橙色）、3，3’二氨基联苯胺（DAB）（黄褐色）。

（2）碱性磷酸酶

底物:对硝基苯磷酸盐（黄色）。

1.酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

酶联免疫吸附试验是利用抗原或抗体能非特异性吸附于聚苯乙烯等固相载体表面的特性，使抗原-抗体反应在固相载体表面进行的一种免疫酶技术。

（1）间接法

间接法是用已知抗原检测未知抗体的一种检测方法。用已知抗原包被固相，加入待检血清标本，再加酶标记的二抗，加底物观察显色反应（图10-16）。

图10-16　ELISA间接法示意图

（2）双抗体夹心法

双抗体夹心法是用已知抗体检测未知抗原的一种检测方法。将已知抗体包被固相载体，加入的待检标本若含有相应抗原，即与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合成分，加入该抗原特异的酶标记抗体，洗去未结合的酶标记抗体，加底物后显色。若标本中无相应抗原，固相表面无抗原结合，加入的酶标记抗体不能结合于固相并可被洗涤去除，加入底物则无显色反应（图10-17）。

图10-17　双抗体夹心法示意图

（3）酶联免疫斑点试验

酶联免疫斑点试验（EL ISPOT）有两种方法:

①用已知抗原检测分泌性特异性抗体的B细胞:用已知抗原包被固相载体，B细胞分泌的抗体与之结合，加入酶标记的抗Ig抗体，通过底物显色反应可检测B细胞分泌的特异性抗体。

②用抗细胞因子抗体检测细胞分泌的细胞因子:用抗细胞因子抗体包被固相载体，加入不同来源的细胞，细胞所分泌的细胞因子与包被抗体结合，再加入酶标记的抗细胞因子抗体，通过显色反应测定结合在固相载体上的细胞因子（定性或半定量），并可在光镜下观察分泌细胞因子的细胞（图10-18）。

图10-18　酶联免疫斑点试验示意图

（4）生物素-亲合素法

生物素（biotin）又称维生素H，是从卵黄和肝中提取的一种小分子物质（分子量244.31kD）；亲合素（avidin）又称卵白素，是从卵白中提取的一种糖蛋白（分子量68kD）。每个亲合素分子有生物素结合的4个位点，二者可牢固结合成不可逆的复合物。生物素-亲合素的应用大致有三种方法（图10-19）。

①标记亲合素-生物素法（labelled avidin-biotin method，LAB法）:将亲合素与标记物（HRP）结合，一个亲合素可结合多个HRP；将生物素与抗体（一抗与二抗）结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。细胞的抗原（或通过一抗）先与生物素化的抗体结合，继而将标记亲合素结合在抗体的生物素上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性。

②桥连亲合素-生物素法（bridged avidin-biotin method，BAB法）:先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲合素将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，也达到多层放大效果。

图10-19　生物素-亲合素法示意图

③亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法（avidin-biotin-peroxidase complex method，ABC法）:此法是前两种方法的改进，即先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合在一起，形成亲合素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC复合物），标本中的抗原先后与一抗、生物素化二抗、ABC复合物结合，最终形成晶格样结构的复合体，其中聚合了大量酶分子，从而大大提高了检测抗原的灵敏度。

2.免疫组化技术

免疫组化技术（immunohitochemistry techenique）是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术（immunohistochemistry）或免疫细胞化学技术（immuno-cytochemistry）。

众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等（图10-20）。

图10-20　双标记免疫组化染色技术示意图

（三）放射免疫测定

放射免疫测定（radioimmunoassay，RIA）是将放射性同位素分析的高度灵敏性与抗原-抗体反应的高度特异性有效结合而建立的一种检测技术。

同位素:¹³¹ I、¹²⁵ I、³ H、¹⁴ C、³² P等。

特点:灵敏度高，能测出ng/m l（ug/L），甚至pg/m l（ng/L）水平的微量物质，试验快速、准确，可规格化，重复性好。

缺点:放射性同位素有一定的危害性，且易污染环境，因此其应用受到一定限制。

方法:（1）液相放射免疫测定、（2）固相放射免疫测定。

（四）化学发光免疫分析

将发光物质（如吖啶酯、鲁米诺等）标记抗原或抗体，发光物质在反应剂（如过氧化阴离子）激发下生成激发态中间体，当回复至稳定的基态时发射光子，通过自动发光分析仪测定光子产量，可反映待检样品中抗体或抗原含量（图10-21）。

（五）免疫印迹法

免疫印迹法（immunoblot）又称Western印迹法，其结合凝胶电泳与固相免疫技术，将借助电泳所区分的蛋白质转移至固相载体，再应用酶免疫、放射免疫等技术进行检测。本方法包括5个步骤:

（1）固定:蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（P抗原E）并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。

图10-21　化学发光免疫分析

（2）封闭:保持膜上没有特殊抗体结合的场所，使场所处于饱和状态，用以保护特异性抗体结合到膜上，并与蛋白质反应。

（3）初级抗体（第一抗体）是特异性的。

（4）第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。

（5）适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。

该法能对分子大小不同的蛋白质进行分离并确定其分子量，常用于检测多种病毒抗体或抗原。

（六）免疫金技术

免疫金技术是一种以胶体金作为标记物的免疫标记技术。胶体金是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液，颗粒大小多在1～100nm。

胶体金的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关，一旦颗粒大小发生变化，光散射也随之发生变异，产生肉眼可见的显著的颜色变化。小:2～5nm，橙黄色。中:10～20nm，酒红色。大:30～80nm，紫红色。

（七）免疫比浊

免疫比浊（immunonephelometry）是在一定量抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间形成免疫复合物，液体混浊。用浊度计测量反应体系的浊度，可绘制标准曲线并依据浊度推算样品中抗原含量。