微生物菌种的分离筛选

实验十七　微生物菌种的分离筛选

一、实验目的

（1）学习掌握常见工业微生物菌种的分离筛选技术。

（2）学习掌握选择性培养基的设计与制备使用。

二、实验原理

利用微生物生命活动的不同，以及它们对环境的响应，可对微生物菌种进行分离筛选。目前所采取的主要是富集培养与选择性抑制培养。富集培养就是在特定的与所需要富集的微生物菌种性质相应的条件下，使目标微生物快速生长，而达到富集培养分离筛选的目的。选择性抑制培养主要是采用相应药物或试剂对非目标菌的生长进行抑制，使目标菌迅速成为优势菌，有利于达到分离筛选的目的。根据分离目标菌的不同，通常采用不同的药物。

土壤是微生物的大本营，因此土壤样品通常成为分离微生物菌种的主要来源。此外，对于生产性状衰退的生产菌种，从中选优也是菌种分离筛选的重要来源。

三、实验器材

（一）样品

醋醪样品、已退化的灰色链霉菌斜面。

（二）培养基

（1）米曲汁碳酸钙乙醇培养基：米曲汁（10°Brix）100mL，CaCl21克，95%乙醇3～4mL，pH自然。配制时不加入乙醇，灭菌后使用前加入。

（2）葡萄糖天冬素培养基。

（三）玻璃器皿若干

略。

四、实验步骤

（一）醋酸菌的分离筛选

1．富集培养

取醋醪样品接种于米曲汁硫酸钙乙醇液体培养基中（加入3%～5%乙醇），30℃振荡培养过夜。镜检且有醋味即可作平板分离。

2．平板涂布分离

（1）采用10倍稀释法对上述培养物进行适当稀释后，用移液器吸取0．1mL至无菌的米曲汁碳酸钙乙醇固体培养基中（制备平板前临时加入乙醇），采用无菌涂布棒在平板表面涂布，连续涂5块平板。30℃培养3～5d。

（2）观察并记录菌落的出现及其周围透明圈的有无和大小。

（3）挑取透明圈大的单菌落，采用划线分离的方法再接种于米曲汁碳酸钙乙醇固体培养基平板，30℃培养3～5d。

（4）挑取透明圈大的单菌落，接种于米曲汁碳酸钙乙醇固体培养基斜面，30℃培养3d。革兰氏染色、形态观察，4℃冰箱保存。

3．醋酸菌进一步分离鉴定

可采用16SrRNA测序等方法对醋酸菌进行鉴定。分离筛选流程图如图17－1所示。

（二）灰色链霉菌的分离筛选

1．活化菌种：将原始菌种转接到培养基平板，于28℃恒温培养，培养3～5d后将孢子转接至试管斜面，28℃恒温培养3d。

2．孢子悬浮液制备：10mL无菌水将斜面孢子悬浮，取1mL悬浮液至装有50mL无菌水的300mL三角瓶中（带适量玻璃珠），振荡分散均匀，无菌过滤，得孢子悬浮液。

3．计数并稀释：采用血球计数法测定孢子浓度，10倍稀释法适当稀释后取0．1mL涂布葡萄糖天冬素培养基，28℃倒置培养5～7d。

4．挑取单菌落：根据高活力菌种的形态特征，一般挑取菌落比较大、气生菌丝粗壮、孢子茂盛、色泽正常的单菌落至斜面培养保存。

5．镜检：有无杂菌，并进一步测定其效价。

五、实验记录

（1）菌种在平板上的生长状况及菌落周围透明圈的大小。

图17－1　分离筛选流程

（2）镜检结果。

（3）灰色链霉菌的形态特征图示，尤其是孢子丝。

（4）退化菌种与优良菌种的比较。

六、思考题

（1）在分离筛选培养过程中若添加适当浓度的醋酸，对分离结果有何影响？

（2）碳酸钙的作用是什么？

（3）退化菌种的选优过程中，如何提高选优的效率？

（4）菌种退化的主要原因有哪些？

参考文献

［1］杜连祥．工业微生物学实验技术［M］．天津：天津科学技术出版社，1992．