体外培养动物细胞的生物学特性

体外培养动物细胞的生物学特性_动物细胞培养技术

任务2　体外培养动物细胞的生物学特性

体外培养的组织细胞源于生物体内，其生物学特征具有两重性。一方面，它的基本生物学特征仍与体内细胞的相似；另一方面，培养物在体外条件下生长，由于生长环境的差异，尤其是失去了有机体整体的生长调节机制，许多生长生物学行为将会发生改变，形成了其特有的生长、分化及增殖规律。

一、体外培养细胞的生长方式及类型

体外培养的细胞，按其生长方式可分为贴附生长型与悬浮生长型两大类。

1.贴附生长型细胞

贴附生长型细胞为能附着于底物（支持物）表面生长的细胞，又称为贴壁依赖性细胞。活体体内的细胞当被置于体外培养时大多数以贴附型方式生长。

目前已有很多种细胞能在体外培养生长，这些细胞在活体体内时，各自具有其特殊的形态，但是处于体外培养状态下的贴附生长型细胞则常在形态上表现单一化而失去其在体内原有的某些特征。贴附生长的体外培养的细胞从形态上大体可分为以下几类（图1-5）。

图1-5　细胞的不同形态

（a）上皮型细胞；（b）成纤维型细胞；（c）游走型细胞；（d）多形型细胞

（1）上皮型细胞。这类细胞在形态上多呈扁平不规则多角形，卵圆形的细胞核位于细胞质的中央，细胞紧密相靠、互相衔接成片，或呈镶嵌状紧密排列，相互拥挤而呈现“铺路石”样。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞（如皮肤表皮及其衍生物，消化管上皮，肝、胰、肺泡上皮等的细胞）皆为上皮型细胞。

（2）成纤维型细胞。起源于中胚层的组织细胞，体外培养时属于此类，如纤维结缔组织、平滑肌、心肌、血管内皮等在体外培养条件下都为成纤维型细胞。这类细胞的形态为纤维状，具有长短不等的数个细胞突起，因而多呈梭形、不规则三角形或扇形，核靠近细胞质的中央。其生长特点为，细胞不紧靠相连成片，而是排列为旋涡状、放射状或栅栏状。

（3）游走型细胞。游走型细胞在支持物上呈散在生长，一般不连成片，细胞质常伸出伪足或突起，呈活跃游走或变形运动，运动速度快而方向不规则，此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。

（4）多形型细胞。多形型细胞由于难以确定其形态而得名，如神经细胞，难以确定其稳定的形态，可统归于此类。

以上分类仅是为了实际工作的方便而进行的笼统提法。体外的细胞不能等同于体内相应类型的细胞，仅是其形态与体内的上皮细胞的形态类似，而且仅是描述细胞的外形而并非说明细胞的起源，两种形态类似的细胞可能来自不同性质的细胞亚类。取自不同组织的上皮细胞，其生化特征及其原来的形态会有差异，而来自不同组织的形态相似的成纤维细胞，其发展的趋向可能并不相同。例如，可从脾脏及骨髓分别分离出形态相似的“成纤维细胞”，当接种这些细胞于同源的动物时，只有那些来自骨髓的“成纤维细胞”才有可能形成骨样组织。因此，采用上皮样细胞或成纤维样细胞这样的名词更为恰当。此外，体外培养的细胞的形态并不完全恒定，可因各种因素而发生改变，包括pH值、细胞密度、污染等的影响。例如，Vero细胞（图1-6）本身是上皮型细胞，但若培养的环境酸性或碱性过强，则可呈现为梭形而似成纤维细胞；有些细胞在高血清浓度生长时为细长的成纤维细胞状，在低血清浓度生长时则更似上皮细胞。

图1-6　Vero细胞

2.悬浮生长型细胞

少数类型的细胞在体外培养时不需要附着于底物而在悬浮状态下即可生长，包括一些取自血、脾或骨髓的细胞（尤其是血液细胞）以及癌细胞。这些细胞在悬浮状态生长良好，多呈圆形。由于悬浮生长于培养液之中，因此其生存空间大，具有能够提供大量细胞、传代繁殖方便（只需稀释而不需消化处理）、易于收获等优点，并且适于进行血液病的研究。其缺点是不如贴附生长型细胞观察方便，而且并非所有的培养细胞都能悬浮生长。图1-7所示为悬浮生长的红细胞。

图1-7　悬浮生长的红细胞

二、体外培养细胞的生长特点

细胞在体外培养生长时具有一些特点，突出的特点是贴附、接触抑制和密度抑制。

1.贴附

贴附并伸展是多数体外培养细胞的基本生长特点。虽然血细胞（如淋巴细胞）在活体体内并无聚集的倾向并在体外可于悬浮状态下生长，但是大多数的哺乳动物细胞在体内和体外均附着于一定的底物而生长，这些底物可以是其他细胞、胶原、玻璃或塑料等。培养细胞在未贴附于底物之前一般呈球体样；当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态，呈成纤维细胞样或上皮细胞样等。

细胞的贴附和伸展可分为几个阶段，以成纤维细胞为例，一般在接种细胞后5～10 min便可见细胞以伪足附着，与底物形成一些接触点；接着细胞逐渐呈放射状伸展开，细胞体的中心部分也随之变扁平；最后细胞呈成纤维细胞的形态。细胞的贴附和伸展如图1-8所示。图1-9所示为扫描电镜下大鼠成纤维细胞的贴附伸展过程。

图1-8　细胞的贴附和伸展

图1-9　扫描电镜下大鼠成纤维细胞的贴附和伸展过程

（a）30min，吸附；（b）60min，接触；（c）2h，贴壁；（d）24h，扩展

细胞附着于底物是一种不需要能量的过程，一般认为与电荷有关。一些特殊的促细胞附着的物质（如基膜素、纤维连接素、Ⅲ型胶原、血清扩展因子等）可能参加细胞的贴附过程。这些促细胞附着因子均为蛋白质，存在于细胞膜表面或培养液血清之中。在培养过程中，这些带正电荷的促贴附因子先吸附于底物上，悬浮的圆形细胞再与已吸附有促贴附因子的底物附着，随后细胞将伸展成其原来的形态。一般来说，从底物脱离下来的贴附生长型细胞不能长时期在悬浮状态下生长，除非这是一些转化了的细胞或恶性肿瘤细胞。

细胞的贴附和伸展，首先需要底物具备一定的条件（如上述的促贴附因子等），此外还受一些其他因素的影响。例如：

（1）离子的作用，如细胞的伸展需要有钙离子的存在，钙浓度低的培养液不利于细胞的伸展；

（2）机械、物理因素也可影响细胞的附着，如低温或培养液的流动过快均可妨碍细胞的附着。

有些生物因素对细胞的伸展可能有影响，如表皮生长因子可刺激神经胶质细胞的皱褶样活动，成纤维细胞生长因子能减少3T3细胞在底物上的扁平程度。

2.接触抑制

接触抑制（contact inhibition）是体外培养中某些贴附生长型细胞的生长特性之一，是指当一个细胞被其他细胞围绕以致无处可去而发生接触时，细胞不再移动，接触区域的细胞膜皱褶样运动停止的现象。在培养细胞的数量适宜的情况下，细胞膜会出现特征性的皱褶样活动，细胞快速生长增殖。随着细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少，最后细胞相互接触汇合成片，发生接触抑制。接触抑制保证了正常细胞在培养中不会发生重叠，而恶性肿瘤细胞无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常细胞与转化细胞或恶性肿瘤细胞的标志之一。转化细胞或恶性肿瘤细胞由于无接触抑制而能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积。细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够维持生命活动。

3.密度抑制

培养器皿中细胞过少或过密都会影响细胞的生长、增殖。当细胞贴附生长、汇合成单层时，细胞变得较为拥挤，而扁平的程度减少，与培养液的接触面减小，同时，培养液中的一些营养物逐渐被消耗掉，一些代谢产物的增加使pH值改变，此时单层细胞的分裂活动停止，这种细胞可在静止状态下存活一段时间，但不发生分裂增殖，这种生长特性称为密度抑制（density inhibition）。由于转化细胞和肿瘤细胞与正常细胞不同，因此可以生长至很高的细胞密度。

三、体外培养细胞的生长过程

（一）单个细胞的生长过程：细胞周期

细胞周期（cell cycle）是为研究细胞的生长行为而提出来的。细胞生长包括DNA合成及细胞分裂两个关键过程。细胞周期即一个母细胞分裂结束后形成新细胞至下一次分裂结束形成两个子细胞的时期，可分为间期和M期（分裂期）两个阶段。细胞群中多数细胞处于间期，少数细胞处于M期。一般间期较长，占细胞周期的90%～95%；M期较短，占细胞周期的5%～10%。细胞种类不同，一个细胞周期的时间也不相同。

在间期，细胞完成生长过程，主要为DNA的合成，即遗传物质DNA的复制。在间期中，DNA合成仅占其中的一段时间，称为DNA合成期（S期）；在S期之前和S期之后，分别有两个间隙阶段，称为DNA合成前期（G₁期）及DNA合成后期（G₂期）。因此，可将细胞周期归纳如下：

间期＝G₁期＋S期＋G₂期

细胞周期＝间期＋M期＝G₁期＋S期＋G₂期＋M期

M期为有丝分裂期，是细胞周期的终结期，此时每个细胞将分裂成2个子细胞。在M期，细胞所完成的主要是分裂，即遗传物质的分配。细胞处于分裂时称为分裂相。细胞分裂相的多少可作为判断细胞生长状态和增殖旺盛情况的重要参考指标。M期很短，也较稳定，一般只有1～2h。细胞分裂的进程又分为前、中、后、末4期。

细胞周期见表1-3及图1-10。

表1-3　细胞周期

续表

图1-10　细胞周期

（二）细胞系的生长过程

1.概述

取自动物并置于体外培养中生长的细胞在其传代之前称为原代培养或原代细胞。当细胞持续生长繁殖一段时间，达到一定的细胞密度之后，就应将细胞分离成两部分（或更多）至新的培养器皿并补充更新培养液，此即传代（passage）或再培养（subculture）。传代生长以后，便成为细胞系（cell line）。一般正常细胞的这种细胞系的寿命只能维持一定的时间期限，称为有限生长细胞系（limited growth line）。

因此，在体外培养的细胞，其生命的期限并非无限的。当细胞自动物体内取出后，在培养中大多数的细胞仅在有限的时间内持续生长，然后将自行停止生长。即使提供这种细胞生长所需的包括血清在内的营养物质，细胞最终仍会死亡。细胞系在培养中能够存活时间的长短主要取决于细胞来自于何种动物。例如，人胚成纤维细胞约可培养50代；恒河猴的皮肤成纤维细胞能传代超过40代；鸡胚胎成纤维细胞在培养中则最多只有少数克隆能群体倍增30多次；小鼠成纤维细胞的寿命最短，正常者多数生长8代左右。

在体外培养时，不同组织来源以及不同年龄的人成纤维细胞的平均寿命也是不同的。例如，从年老的个体取得的成纤维细胞的寿命比取自年轻者的短。此外，可能影响培养细胞寿命的因素还有培养的条件等，如在上皮细胞的培养液中加入表皮生长因子，则可使之延缓衰老，寿命可从50代延长到150代。虽然体外培养的细胞最终会死亡，但还是可以生长一段时间。例如，培养成纤维细胞，若从10⁶个细胞开始，理论上成倍生长50次即可产生10⁶×2⁵⁰个细胞。因此，若小心地按一定的操作要求维持其生长，一个培养物有可能用于研究一段相当长的时间。

2.体外培养细胞的寿命过程

体外培养细胞的寿命过程一般分为以下三个阶段。图1-11所示为体外培养细胞的整个生命活动过程。

图1-11　体外培养细胞的整个生命活动过程

（1）原代培养或初代培养期：指新鲜组织自体内取出并在体外培养生长至第一次传代的时期，一般为1～4周。原代培养通常为异质性，含较少的生长组分，为二倍体核型。此期中的细胞移动比较活跃，有细胞分裂但并不旺盛。原代培养的细胞与体内相应的细胞性状相似，更能代表其来源组织的细胞类型及组织特异性。因此，原代细胞是良好的实验对象，如用于药物实验等。但需要注意的是此期生长细胞包含的类型较多。

（2）传代期：原代培养的细胞生长一定时间后，即融合成片而逐渐铺满底物的表面。此时，便应将原代细胞分开接种至2个或更多个新的培养器皿中，即传代。传代大约数天至一周即可重复一次，持续数月，即为细胞系，一般是有限细胞系。传代期的细胞增殖旺盛，一般仍然是二倍体核型，并保留原组织细胞的很多特征。但当继续长期反复传代，细胞将逐渐失去其二倍体性质，至一定期限后（一般为传代30～50次后）细胞增殖变慢以至于停止分裂，于是进入衰退期。

（3）衰退期：一般有限细胞系在此期开始时虽仍然存活，但增殖已很缓慢并逐渐完全停止，进而细胞发生衰退、死亡，此即体外培养细胞的“危机期（crisis）”。有限细胞系在生长过程中若不能通过“危机期”，将进入衰退期而趋于死亡。但是，并非所有原代培养的传代细胞最后全部发生死亡，传代中偶尔可有极少的后代细胞能通过“危机期”，获得不死性而具有持久或无限增殖的能力。这种细胞称为无限细胞系或连续生长细胞系（infinite cell line）。培养细胞是否可以获得无限繁殖生长的能力，与其种族、来源及性质有关。例如，鸡细胞在数次成倍生长后即死亡，即使是鸡的肿瘤细胞也不能成为连续生长细胞系；人的肿瘤细胞有可能无限地生长；啮齿类动物的胚胎期细胞较易形成不死性的连续生长细胞系。至今，国际及国内已建立了许多细胞系，其中大多数来自肿瘤。

3.细胞的生长过程

如上所述，置于体外培养的细胞，如条件合适，将生长繁殖。在培养器皿中，细胞繁殖到一定程度后，供培养生长的区域被细胞占满，培养液中的营养物质被耗尽，如不及时传代，原代细胞最终死亡。有限细胞系经过一定的代数之后，最终衰退而死亡；连续生长细胞系则因具不死性而可永久地传代、生长。细胞自接种至新培养瓶中，至其下一次再传代接种的时间为细胞的一代（generation）。每代细胞的生长过程可分为三个阶段：细胞先进入生长缓慢的滞留阶段，然后为增殖迅速的对数生长期，最后到达生长停止的平台期。每一代细胞的生长过程如图1-12所示。

图1-12　每一代细胞的生长过程

（1）滞留期：包括悬浮期（游离期）及潜伏期。当细胞接种入新的培养器皿，不论是何种细胞类型，其原来的形态如何，此时细胞的细胞质回缩，胞体均呈圆球形。这些细胞先悬浮于培养液中，短时间后，那些尚可能存活的细胞即开始附着于底物，并逐渐伸展，恢复其原来的形态。再经过潜伏期，此时细胞已存活，具有代谢及运动活动但尚无增殖发生。然后出现细胞分裂并逐渐增多而进入对数生长期。一般细胞滞留期不长，为24～96h。肿瘤细胞及连续生长细胞系则更短，可少于24h。

（2）对数生长期：又称指数生长期。此期细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，适用于进行实验研究。细胞生长增殖状况可以细胞倍增情况（细胞群体倍增时间）及细胞分裂指数等来判断。在此阶段，若细胞处于理想的培养条件，将不断生长繁殖，细胞数量日渐增加。细胞将接触连成一片，逐渐铺满培养器皿底物，提供细胞生长的区域逐渐减少甚至消失，因接触抑制细胞运动停止，因密度抑制细胞终止分裂，细胞不再繁殖而进入平台期。此期的长短因细胞本身特性及培养条件而不完全相同，一般可持续3～5d。

（3）平台期：又称生长停止期。此期可供细胞生长的底物面积已被生长的细胞所占满，细胞虽尚有活力但已不再分裂增殖。此时细胞虽已停止生长，但仍存在代谢活动并可继续存活一定的时间。若及时分离培养、进行传代，将细胞分开接种至新的培养器皿并补充新鲜培养液，细胞将于新的培养器皿中成为下一代的细胞而再次繁殖。否则，若传代不及时，细胞将因中毒而发生改变，甚至脱落、死亡。

每次传代接种后，若在细胞的生长繁殖过程中进行检测计数，可以绘制成曲线，称为生长曲线。细胞的生长曲线各具特点，是该细胞生物学特性指标之一。

四、影响动物细胞体外生长的因素

体外培养的细胞脱离了在体内时的调节和控制，独立面对生长环境中的各种因素，只有适应体外环境条件才能生长。除了向培养基（液）中释放代谢产物或者分泌一些生物活性物质而影响培养基（液）之外，几乎对生长环境产生不了较大的主动影响。但是，如果环境因素发生改变，将会对细胞生长带来明显的影响。

（一）营养成分与生长基质

营养条件是细胞体外生长的基本条件，体外培养细胞的营养条件主要是通过培养液来提供的。在培养液中，除了细胞生命活动所需的各种营养物质之外，还必须具有调节细胞生长与功能活动的激素、生长因子以及生长基质成分等。尽管已开发的各种人工合成培养基成分复杂而且明确，但始终缺乏某些尚不清楚的与细胞生长发育和功能活动有关的微量成分。培养液中一般仍需要加入5%～20%的血清。建立完全满足细胞体外生长要求的无血清培养基是目前研究的热点。

（二）温度

温度能够影响体内细胞的代谢活动。在生理温度范围内，温度越高，酶活性越高，细胞代谢越快，这种相关性同样适用于体外的情况。

大多数动物的生命活动在10～45℃的外界温度范围内进行。然而，每种动物有其最适宜的温度，例如，鸡的适宜温度是38℃，在36～39℃也可以生长，鸡胚组织甚至在26～44℃范围内都可以生长，但生长的速度会受到一定的影响。HeLa细胞最适宜的温度是38℃，在24～40℃范围内仍能生长。大多数动物细胞在25～35℃范围内仍然能够生存和生长。若将培养细胞放在4℃下，数小时后再放回37℃，细胞仍然能够继续生长。

体外培养动物细胞最常用的温度是37℃。培养的细胞对较低温度的耐受能力比对较高温度（一般不超过39℃）的耐受能力强。高于生理温度阈值时，温度越高，对细胞损伤越大。培养的细胞处在39～40℃下1h，即会受到一定的损伤，但仍然可以恢复；在41～42℃下1h，细胞便会受到严重损伤，绝大多数细胞将死亡；当培养温度高达43℃时，1h内细胞将全部死亡。

在生理温度范围内，温度越低，酶活性越低。当温度降至细胞所能忍受的最低限度时，细胞的生命活动即会受到抑制。如果将鸡胚细胞在0.5℃环境下冷处理4h，恢复至正常温度时仍可以很好地生长，只不过要有一定的恢复期。不同细胞能够忍受的低温阈值不同，能够忍受低温环境的时间长短也不同。低温条件能造成一定的细胞死亡。例如，人的淋巴细胞对低温比较敏感，当在3℃培养时，死亡率可达30%；当在19℃培养时，死亡率为20%；当在36～39℃培养时，死亡率仅为1.6%；当在40℃培养时，死亡率又升至4.6%。当将细胞暴露在冰点温度时，细胞外环境中的水结冰，细胞外溶液的渗透压增高，细胞内的水向外移动，细胞发生缩水，结果使得细胞浆浓度增大，引起细胞死亡。同时，细胞的代谢受到抑制。冰晶的形成也会对细胞造成一定的伤害。

（三）气相环境

培养细胞的气相环境尤其是O₂和CO₂对细胞生长也有影响。O₂参与细胞的能量代谢过程，而CO₂对维持培养液的酸碱度很重要。体外培养的气相条件主要取决于培养物的类型、培养液的类型、培养系统（开放式或密闭式系统）以及需要的缓冲能力等因素。细胞培养与器官培养的气相环境差别较大。

对于绝大多数开放式培养系统来讲，动物细胞培养的气相环境都是采用5%CO₂与95%空气的混合气体。个别类型细胞生长需要有别于此的气相条件。

除少数可以糖酵解途径获得能量的动物细胞及微生物之外，大多数动物细胞在缺氧条件下不能生存。对于封闭式培养的单层细胞，氧分压的适宜范围为1995～9975Pa。培养液中的溶解氧浓度一般为7.6μg／mL。因此，无论是开放式培养还是密闭式培养，不论是常规实验室培养还是大规模培养，给培养物提供足够的O₂是必需的。然而，气相环境中O₂含量超过大气中的O₂含量时，对培养细胞也会产生毒害作用。

（四）培养液的酸碱度

大多数细胞能在pH6.0～8.0的环境中生存，最适宜的pH值范围是7.2～7.4。人类血液的pH值一般恒定在7.4左右。当人类血液的pH值降至7.0时，可引起酸中毒，导致昏迷甚至死亡；当pH值升至7.8时，能引起手足抽搐甚至死亡。培养的细胞若处于过酸或过碱的环境中，同样会发生酸中毒或碱中毒。

体外培养的正常细胞耐酸能力要强于耐碱能力。发生恶变的细胞常常比正常细胞能忍受更广的pH值范围。继代培养的细胞忍受酸碱度变化的能力略强于原代培养的细胞。研究发现，有机酸对细胞的损害比无机酸要大，一般的顺序是：硫酸或盐酸＜磷酸＜柠檬酸＜乳酸＜醋酸。

酸碱度可以影响各种弱酸进出细胞。在酸性环境中生长时，H＋可使H2CO₃以分子的形式进入细胞，并在细胞内进行分解而使得细胞内酸化。相反，当在碱性环境中生长时，H2CO₃可以从细胞内出来，与培养液中的碱结合，形成重碳酸盐。

CO₂是细胞代谢产物，直接释放到培养液之中，积累较多时会引起培养液变酸。一般需在培养液中加入缓冲剂以维持pH值在适宜范围。

（五）辐射

动物细胞一般在持续黑暗的条件下培养。能够对体外培养的细胞生长产生影响的射线包括可见光、紫外线、X射线、β射线以及γ射线等。

1.可见光

由于动物细胞在体内时是生长在黑暗环境中，故培养动物细胞一般也是在黑暗条件下进行。如果给培养的细胞提供光照条件，将会对细胞的生长产生一定的影响。多数有关光照与动物细胞生长关系的研究结果表明，光线能够促使培养的细胞发生退化。此外，不同波长的光线对细胞生长的作用有所不同，不同细胞对于光线照射的反应有差异。

2.紫外线

紫外线在细胞培养方面的应用主要是灭菌或消毒。紫外线能够影响细胞的生命活动，对细胞生长造成破坏。不同波长的紫外线对细胞造成的伤害程度不同，波长越短的紫外线损伤越严重。不同细胞对紫外线的敏感性是不同的。例如，HeLa细胞相对于成年人的成纤维细胞，对紫外线的反应更敏感，而胚胎成纤维细胞又比成年人的成纤维细胞对紫外线更敏感。紫外线对细胞生长的影响主要在于能破坏细胞的遗传物质和蛋白质结构。

3.X射线、β射线与γ射线

不同类型的细胞对X射线、β射线与γ射线的反应不同，反应也因射线剂量与细胞生长条件不同而有所不同。低剂量时将缓慢降低细胞的增生率，高剂量时将对培养细胞产生致死效应。X射线照射后，尽管细胞的运动与代谢活动仍可进行，生长仍在继续，但分裂活动受到抑制。例如，HeLa细胞在受到10Gy剂量X射线照射后，部分细胞可发展成为巨细胞，细胞体积会比正常HeLa细胞的体积大许多倍。随着照射剂量的加大，HeLa细胞迅速退化。1000Gy的高剂量可引起全部细胞即刻停止活动而死亡。现已明确，X射线照射能够引起染色体发生畸变。

β射线与γ射线对培养细胞造成的影响与X射线相似，主要也是通过引起染色体发生畸变而致细胞分裂活动发生异常或受到抑制。若超过一定剂量，会引起细胞死亡。

射线对细胞生命活动的影响也有有益的应用。例如，体外培养某些难以存活的细胞或者某些有特殊需要的细胞（如胚胎干细胞、单细胞克隆等）时，经常将这些细胞接种在一些能分泌促分裂增殖活性因子、促生长活性物质或干细胞因子的饲养层细胞上，为了防止饲养层细胞增殖，一般先以一定剂量射线照射饲养层细胞，这样既能在一定时间内保持饲养层细胞产生促生长活性物质的能力，又能抑制饲养层细胞的分裂增殖活动。

（六）超声波

超声波对培养的细胞一般会产生破坏作用，强度稍大时，会造成细胞破裂。超声波主要是通过空化作用而引起细胞死亡的。另外，超声的机械作用、热学作用以及化学作用等都能对细胞产生很大影响。不同的细胞对超声波的敏感性不同。衰老的细胞对超声波的破坏作用特别敏感。成纤维细胞、成肌细胞和内皮细胞对超声波都很敏感，而上皮细胞对超声波有较强的抵抗力。

（七）影响细胞生长的其他因素

1.橡胶的毒性作用

橡胶制品（如胶塞、橡皮垫、吸管帽和各种橡皮管等）是体外培养工作中常用的物品，而普通的橡胶对细胞都有毒。有人曾将普通胶塞浸于合成培养液中1周，然后用这种培养液培养细胞，发现这种培养液能在48h内造成培养细胞死亡。许多实验室为了去除新胶塞上的污垢，常常用热碱与热酸煮沸处理，事实上并不能明显降低其毒性作用。如果用乙醚或者乙醚、丙酮和乙醇联合处理，能够较好地降低橡胶制品的毒性作用。一般来说，纯橡胶与硅胶的毒性较弱，黑橡胶的毒性较强。

2.离心处理

离心处理是培养过程中不可缺少的环节。在用消化酶作用后，为了去除细胞悬液中的含酶溶液，需要通过离心除去上清液；在原代培养前分离目的细胞，需要使用密度梯度离心法处理。离心力对细胞是有影响的。离心力越大，对细胞造成的伤害越大。普通离心比密度梯度离心所造成的伤害要大。普通离心一般使用低于1000r／min的转速，离心时间常为5～10min。如果离心的目的只是排除细胞悬液中的含酶溶液，尽量不要采用过高的速度和过长的时间，应尽可能减少离心的次数，只要能将细胞沉淀下来即可。离心处理对生命力脆弱的细胞（如神经元）的伤害要比生命力旺盛的细胞（如肿瘤细胞）大。

3.培养液的冲击力

由于大多数动物细胞属于贴附生长型细胞，如果受到培养液的冲击而致细胞脱壁，必将对细胞生长造成影响，这在用旋转管培养法以及各种大规模培养方法时尤其要注意。培养液的过激流动除了直接对细胞产生冲击力之外，液体流动时产生的气泡对培养细胞的影响更为突出。

4.培养液的渗透压

尽管大多数操作者都知道细胞必须生长在等渗溶液中，但在具体培养过程中往往不注意或者不容易控制培养液的渗透压，尤其在往合成培养基中添加其他成分时会忽视培养液的渗透压问题。人血浆的渗透压约为290mOsm／kg，此值可作为培养液渗透压的理想参考值。大多数细胞的适宜渗透压范围为260～320mOsm／kg，但不同细胞的适宜渗透压值可能有差异，须视具体情况进行调整。

知识拓展

Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）是从非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来的，是细胞培养中常用的一个细胞系。这个细胞系由日本千叶大学的Yasumura和Kawakita于1962年扩增出来。该细胞系取“Verda Reno”（世界语，意为“绿色的肾脏”）的简写而命名为“Vero”，而“Vero”本身在世界语中也有“真相”的意思。该细胞易于培养，适合大规模生产。这种细胞作为人用疫苗的细胞基质是安全可靠的，已经被世界卫生组织推荐作为生产人用疫苗的理想细胞基质。

3T3细胞是指G.J.Todaro等从Swiss系小鼠胎儿里得到的细胞株。由于它显示出强烈的接触抑制作用，所以能明确地识别已发生转化的细胞，并可作为一种重要的细胞材料应用于由肿瘤病毒和致癌剂等所引起的体外致癌研究。这一细胞系是将3×10⁵细胞接种在底部直径为5cm的培养皿上，根据每三天进行一次连续培养的方法而建立的，“3T3”这一名称便由此而得。同样，由6×10⁵细胞或12×10⁵细胞进行接种而得的细胞株分别称为3T6和3T12，这些细胞的接触抑制作用很弱。此外，在与3T3同一类的细胞中，有来自Balb／C系小鼠的Balb 3T3细胞。

电离辐射传递给每单位质量的被照射物质的平均能量，称为吸收剂量。吸收剂量的国际单位是戈瑞（Gy），专用单位是拉德（rad），两者的换算关系是1Gy＝1J／kg＝100rad，1rad＝10^-2 Gy＝100erg／g。单位时间内的吸收剂量称为吸收剂量率，其单位是戈瑞／小时（Gy／h）。

思考题

1.什么是贴附生长型细胞和悬浮生长型细胞？

2.上皮型细胞的起源及主要形态学特征是什么？

3.什么是细胞的接触抑制？

4.成纤维型细胞的起源及主要形态学特征是什么？

5.简述体外培养细胞的生长类型。

6.简述体外培养细胞的生长过程。

7.影响细胞黏附和贴壁的因素是什么？

8.简述传代培养期的概念及特点。