核酸的理化性质及其应用

核酸的理化性质及其应用_生物化学

第三节　核酸的理化性质及其应用

一、核酸的紫外吸收特性

嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，有很强的紫外吸收特性，使得核酸也具有紫外吸收的特性，最大吸收峰在260nm附近（图3－9）。因此，可以用紫外吸收值A_260nm对样品进行定量分析。

图3－9　不同状态DNA的紫外吸收光谱

注：1为天然DNA；2为变性DNA；3为降解的DNA。

图3－10　DNA热变性曲线

二、核酸的变性、复性与杂交

1．核酸的变性

核酸的变性是指在某些理化因素作用下，核酸分子中双螺旋之间的氢键断裂，使其空间结构被破坏（一级结构不变）的过程。DNA分子变性时，双链会解成单链；RNA分子变性时，局部双螺旋解开，形成线性单链结构。引起核酸变性的因素有化学因素（如强酸、强碱、尿素等）和物理因素（如高温等）。

核酸变性后，致使双螺旋内侧的碱基外露，对波长为260nm的紫外光吸收明显增强，此现象称为增色效应。

升高温度而引起的DNA变性称为DNA热变性，又称为DNA的解链或熔解作用。DNA热变性一般在较窄的温度范围内发生，就像晶体在熔点时突然熔化一样。DNA的热变性曲线（图3－10）显示：DNA在狭窄温度范围内，其吸光度值A_260nm发生“突变”。将突变区的中点所对应的温度（即有一半DNA发生变性的温度）称为解链温度或熔解温度，用Tm表示。研究发现，Tm的大小与DNA的碱基组成有关，G、C含量高的DNA其Tm值高，这是因为G－C碱基对之间有三个氢键，从而提高了DNA的稳定性。研究发现，在离子浓度较高的溶液中，DNA的Tm值也较高。

2．DNA复性

变性后DNA在适宜条件下，两条彼此分开的互补链可重新恢复成双螺旋结构，这个过程称为DNA的复性。热变性的DNA经缓慢冷却而复性的过程称为退火。DNA复性后，对紫外光的吸收明显减弱，这种现象称为减色效应。

3．核酸的杂交

将不同来源的DNA经热变性后降温，使其复性。在复性过程中由于异源的DNA单链之间具有一定的互补序列，它们可以结合形成杂交的DNA分子，DNA与互补的RNA之间也能形成杂交分子。形成这些杂交分子的过程，统称为核酸分子杂交。用标记（放射性或非放射性标记）的已知序列的单核苷酸片断作为探针，通过核酸分子杂交技术，既可以定性或定量检测目标DNA或RNA片段，又可以进行基因结构分析、基因定位、遗传病的诊断及亲子鉴定等。核酸杂交技术可分为Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、斑点杂交、原位杂交等类型。

知识链接

核酸杂交技术

Southern印迹杂交：实验室利用杂交检测DNA的一种方法。该方法由英国分子生物学家E．M．Southern建立，是指将经限制性内切酶酶切后的DNA样品电泳分离，用碱溶液处理电泳凝胶使DNA变性后转移到硝酸纤维素膜上（硝酸纤维素膜只吸附变性DNA）。首先将膜在80℃下烘烤4～6h，使DNA能牢固地吸附在硝酸纤维素膜上，再用含变性鲑鱼精子DNA（该DNA与哺乳动物DNA同源性差）的预杂交液封闭膜上非特异性的吸附位点，然后与标记的DNA探针进行杂交，将膜进行洗涤以除去未杂交的标记物，最后将硝酸纤维素膜烘干后进行放射自显影，观察杂交情况并进行分析。

Northern印迹杂交：实验室利用杂交检测RNA的一种方法，其基本原理和过程与Southern印迹杂交相似。

斑点杂交：将DNA或RNA变性后直接点样到硝酸纤维素膜上进行杂交检测的方法，该方法简单、快速。

原位杂交：将DNA或RNA保持在原位（细胞或组织切片中），经适当处理后进行杂交检测的方法。

DNA指纹技术

生物个体间的差异本质上是DNA分子序列的差异，人类不同个体（同卵双生除外）的DNA各不相同。如人类DNA分子中存在着高度重复的序列，不同个体重复单位的数目不同，差异很大，但重复序列两侧的碱基组成高度保守，且重复单位有共同的核心序列。因此，针对保守序列选择同一种限制性核酸内切酶，针对重复单位的核心序列设计探针，将人类基因组DNA经酶切、电泳、分子杂交及放射自显影等技术处理后，可获得检测的杂交图谱，杂交图谱上的杂交带数目和分子量大小具有个体差异性，这如同一个人的指纹图形一样各不相同。因此，把这种杂交带图谱称为DNA指纹。DNA指纹技术已被广泛应用于法医学（如物证检测、亲子鉴定等）、疾病诊断、肿瘤研究等领域。结合DNA体外扩增技术，法医可以对现场检材（如一根毛发、一滴血、少许唾液、单个精斑等）的DNA指纹进行检测分析，与嫌疑对象进行比对，确定两者的关系，对刑事侦查具有非常重要的意义。

本章小结

核酸是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，分为DNA和RNA两大类。核苷酸由碱基、戊糖和磷酸组成。碱基分为嘌呤碱和嘧啶碱两类：嘌呤碱有腺嘌呤（A）和鸟嘌呤（G）；嘧啶碱有胞嘧啶（C）、尿嘧啶（U）和胸腺嘧啶（T）。戊糖包括核糖和脱氧核糖两种。碱基与戊糖通过糖苷键连接形成核苷，核苷与磷酸通过磷酸酯键连接形成核苷酸，核苷酸之间通过3′，5′－磷酸二酯键连接成多聚核苷酸链。DNA由含有A、G、C、T的脱氧核糖核苷酸组成；RNA由含有A、G、C、U的核糖核苷酸组成。

DNA的结构分为一级结构、二级结构和超螺旋结构。其中，二级结构的要点包括右手螺旋的双链结构、严格的碱基配对、相关数值及稳定因素。DNA的功能是携带遗传信息。RNA包括mRNA、tRNA、rRNA。成熟的mRNA含有5′－末端的5′－帽结构和3′－末端的poly（A）尾结构，中间是编码序列。tRNA的二级结构呈三叶草形，含有较多的稀有碱基。rRNA与多种蛋白质构成核糖体。mRNA的功能是蛋白质合成的直接模板；tRNA是氨基酸的载体；rRNA是蛋白质合成的场所。

核酸对260nm的紫外光有最大吸收峰。核酸在强酸、强碱或加热的条件下可发生变性，其本质是双链间氢键被破坏从而解开成单链。在适当条件下，热变性的DNA可重新形成双链DNA，这个过程称为复性。

能力检测

一、案例引导题

下图为研究人员通过亲和层析法纯化DNA疫苗时的层析图谱：

图中显示的DNA紫外吸收曲线洗脱峰所对应的是洗脱液体积，进行离心浓缩后所得到的DNA样品经琼脂糖凝胶电泳检测，呈单一条带。

分析思考：

（1）试解释DNA具有紫外吸收特性的原因？

（2）试说明测定洗脱液紫外吸收峰值的原因？

（3）假设洗脱液温度发生变化，此洗脱液紫外吸收峰的层析谱图是否会发生移位？

二、单项选择题

1．核酸中核苷酸之间是通过（　　）相连接的。

A．2′，5′－磷酸二酯键B．氢键

C．3′，5′－磷酸二酯键D．糖苷键

2．tRNA的分子结构特征是（　　）。

A．有反密码子环和3′－端有－CCA序列　　B．有反密码子环和5′－端有－CCA序列

C．有密码子环　　　　D．5′－端有－CCA序列

3．下列关于DNA分子中的碱基组成的定量关系哪个是不正确的？（　　）

A．C＋A＝G＋T　B．C＝G

C．A＝T　　　　D．C＋G＝A＋T

4．下面关于Watson－Crick　DNA双螺旋结构模型的叙述中哪一项是正确的？（　　）

A．两条单链的走向是反平行的　B．碱基A和碱基G配对

C．碱基之间共价结合　　　　　D．磷酸戊糖主链位于双螺旋内侧

5．关于RNA和DNA彻底水解后的产物正确的是（　　）。

A．核糖相同，部分碱基不同　　B．碱基相同，核糖不同

C．碱基不同，核糖不同　　　　D．碱基不同，核糖相同

6．维系DNA双螺旋稳定的最主要的力是（　　）。

A．氢键B．离子键

C．碱基堆积力D．范德华力

7．Tm是指什么情况下的温度？（　　）

A．双螺旋DNA达到完全变性时　B．双螺旋DNA开始变性时

C．双螺旋DNA结构失去1/2时　D．双螺旋DNA结构失去1/4时

8．双链DNA解链温度的增加，提示其中含量高的是（　　）。

A．A和G　B．C和T　C．A和T　D．C和G

9．某双链DNA纯样品含15%的A，该样品中G的含量为（　　）。

A．35%　B．15%　C．30%　D．20%

10．DNA碱基配对主要依靠（　　）。

A．范德华力　　B．氢键

C．疏水作用力　D．共价键

11．DNA与RNA两类核酸分类的主要依据是（　　）。

A．空间结构不同　　　　　　B．所含碱基不同

C．核苷酸之间连接方式不同　D．所含戊糖不同

12．在一个DNA分子中，若A所占摩尔比为32．8%，则G的摩尔比为（　　）。

A．67．2%　B．32．8%　C．17．2%　D．65．6%

三、拓展题

1．查阅资料，总结DNA指纹技术、Southern印迹杂交技术和Northern印迹杂交技术的具体操作程序。

（彭　坤）