金山1 曹敏慧2 达能太2 李国中2 付登胜2 贺系格吉日格勒2
（1.内蒙古农业大学动物科学与医学院 呼和浩特 010010；2.内蒙古阿拉善左旗兽医工作站 巴彦浩特 750300；3.内蒙古阿拉善左旗敖伦布拉格动物卫生监督站 六团 015213）
摘 要：阿拉善羊传染性腹泻病流行30余年，给畜牧业生产造成巨大的经济损失。自2008年以来在内蒙古农业大学动物医学院的支持下，经过化验分析，搞清是由副结核分枝杆菌引起的副结核病，经药敏试验，副结核杆菌对环丙沙星和卡那霉素极敏，对头孢呋肟中度敏感，给防治提供了科学依据。
关键词：羊；腹泻；病因；研究
阿拉善盟阿拉善左旗发现以体温不升高、顽固性腹泻、高度消瘦为临床特征的腹泻病。感染发病以羊为主，流行以散发或群发为主。发病多集中在冬季、春季的枯草期，水草丰盛的夏、秋季很少发病。但没有明显的季节性。病程长短不一，如不感染其他疾病，病程一般在3～6个月，有的病程长达一年多。最后消耗成皮包骨样而死亡，牧民称其为“青干病”，该病现已扩散蔓延到阿拉善盟全境。为了诊断和治疗阿拉善盟阿拉善左旗羊发生的以腹泻为主要临床症状的疾病，对阿拉善盟阿拉善左旗发生的病羊群中采集的样品进行病原体分离培养、ELISA检测。本实验结果为阿拉善盟阿拉善左旗提供治疗羊腹泻病的科学依据。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1样品
从阿拉善盟阿拉善左旗病羊群中采集的两份血清、两份粪便、两份肠淋巴结。
1.1.2培养基
将上述试剂加于400 ml蒸馏水中，溶解后，115℃灭菌15 min，冷至56℃，加结核杆菌素10 ml，青霉素5万IU，无菌牛血清100 ml，充分混均，分装入试管（放成斜面）和平皿。培养基的最后pH为7.2。
1.1.3染色液
1．抗酸染色液 2．革兰氏染色液
1.1.4ELISA检测盒：购于瑞士爱丁堡试剂盒公司
1.1.5药敏制片：19种抗生素
1.2 实验方法
1.2.1病原体分离鉴定
1.2.1.1分离方法
切取样品肠淋巴结10～20 g，先除去外面脂肪，并剪碎。剪碎组织放入灭菌的乳钵中研磨，边研磨边加0.5%的胰酶水溶液40 ml，使成混悬液，用1 mol/L NaOH调pH为9.0，放在烧杯中，在电磁搅拌器上，于室温下搅拌1 h进行消化。离心（500 r/min）30 min，去上清液，沉淀加20 ml生理盐水，再加等量0.02%孔雀绿水溶液处理杂菌，37℃水浴中放30 min，不时摇振。在离心（500 r/min）30 min，去上清液，去沉淀物接种于改良的Dubos培养基上，并制成抹片，抗酸染色后镜检。
1.2.1.2抗酸染色方法
（1）涂片，干燥，固定。
（2）滴加苯酚复红液微温至现蒸汽并保持染色5 min（不可煮沸，染色液减少时，应随时添加，冷却后水冲洗）
（3）3%盐酸酒精脱色30～60 s。
（4）0.5%亚甲蓝液复染1 min，水洗，干燥，镜检。
1.2.1.3革兰氏染色方法：
（1）涂片，干燥，固定。
（2）滴加结晶紫染色液，染1 min，水洗。
（3）滴加革兰氏碘液，作用1 min，水洗。
（4）滴加脱色酒精，约30 s。
（5）水洗，滴加沙黄复染液，复染1 min。水洗，待干，镜检。
1.2.1.4ELISA检测方法
（1）将已预孵育过的对照和样品各100 μl移至对应的抗原液孔中，封板，室温孵育60 min。
（2）测空孔内液体并加1倍洗液淋洗5次，每次洗涤都要加满最后一次；测控所有空内液体，并去掉孔内残余的液体，每孔加250～300 μl洗液。
（3）各孔加入100μl稀释液，用HRP辣根过氧化物酶封板，室温孵育30min。
（4）洗涤各孔，在黑暗处加100 μl底物液，孵育10 min
（5）10min后加入终止液。
（6）用酶联免疫检测仪450 nm和620 nm双波长测样品。
1.2.1.5ELISA结果判断标准
S/P=（样品OD-阴性OD）/（阳性OD-阴性OD）≤0.15为阴性
S/P=（样品OD-阴性OD）/（阳性OD-阴性OD）在0.15～0.30为可疑
S/P=（样品OD-阴性OD）/（阳性OD-阴性OD）＞0.3为阳性
1.2.1.6药敏实验方法
在无菌条件下，将分离到的副结核杆菌改良的Dubos培养基中加入1 ml灭菌的生理盐水，得到纯培养物用微量移液器吸取200 μl，用涂菌棒均匀涂布于改良的Dubos培养基上。室温放置待表面的菌液充分干燥后，再用无菌镊子将19种药物纸片，按6片/平皿均匀贴于培养基表面。将平皿倒置于37℃温箱中持续培养48～60 h，观察结果。用游标卡尺测量抑菌圈直径并进行记录，进而判断病原菌对各种药物的敏感性。
判断标准：药物抑制能力的判定按中国药品生物制品检定所、国家抗菌药物细菌耐药性监测中心提供的抗菌药物敏感纸片判断标准进行判断。
2结果
2.1分离培养
分离培养结果
分离到的菌株平皿扩大培养结果
2.2染色结果
抗酸染色结果
革兰氏染色结果
2.3ELISA诊断结果
S/P=（样品OD-阴性OD）/（阳性OD-阴性OD）=（1.071-0.1537）/0.3823=2.399＞0.3为阳性
表1 药敏实验结果
9为林可霉素（直径16mm），11为环丙沙星（直径22mm）
13为卡那霉素（直径18mm），16为阿奇霉素（直径15mm）
17为头孢呋肟（直径20mm）
3结论
3.1流行病学调查表明阿拉善盟阿拉善左旗发生的羊腹泻病多集中在冬季、春季的枯草期，水草丰盛的夏、秋季发病少。此外，该病防治难度大、受资金、技术等因素的制约，治愈率与预防效率较低。该病流行病学特点与副结核杆菌病相似。
3.2阿拉善盟阿拉善左旗发生的羊腹泻病的临床症状为：体温不升高、顽固性腹泻、高度消瘦为临床特征。起初为间歇性下痢，后发展到经常性顽固性下痢。粪便稀薄恶臭，带泡沫、黏液或血液凝块。食欲起初正常，精神也良好，逐渐食欲有所减退。随着病程的发展病畜消瘦、眼窝下陷、经常躺卧、泌乳逐渐减少、营养高度不良、皮肤粗糙、被毛松乱、下颌及垂皮可见水肿，最后因全身衰弱死亡，与羊副结核病的症状相似。
3.3从阿拉善左旗发生的羊腹泻病肠淋巴结分离到抗酸染色呈红色，革兰氏染色为阳性的副结核分枝杆菌。两份血清ELISA检测结果为阳性。阿拉善盟阿拉善左旗发生的羊腹泻的致病菌为副结核分枝杆菌，该病诊断为羊副结核病。
4讨论
4.1副结核病是我国《动物防疫法》法定的第二类动物疫病,是指可能造成重大经济损失，需要采取严格控制、扑灭等措施，防止扩散的疫病，同时世界动物卫生组织（OIE）也将其列为B类动物疫病，是指在动物和动物产品的国际贸易中重要的，其传播将造成社会和生态危害的可传播动物疾病。
4.2副结核分枝杆菌（Mycobacterium paratuberculosis），属于分枝杆菌科（Mycobacteriaceae）分枝杆菌属（Mycobacterium）的成员。自1895年报道首例后，相继在许多国家发现此病，现已遍布全球。我国在1975年由吉林农业大学韩有库等分离到此菌。
形态与染色：本菌短粗杆菌，长0.5～1.5 μm，宽0.3～0.5 μm，无鞭毛，不形成荚膜和芽孢，经抗酸染色染成红色，革兰氏染色阳性。
培养特性：本菌营养要求高，专性需氧，最适温度37.5℃，最适pH为6.5～6.8。生长缓慢，初代分离极为困难，需在培养基中添加草分枝杆菌素抽提物，在固体培养基经1～2周才出现肉眼可见的菌落。粪便分离率较低，病变肠断及肠淋巴结分离率较高，常用培养基有Herrald卵黄培养基、小川培养基、Dubos培养基和Waston-Reid培养基。
抵抗力：对自然环境抵抗力较强，在粪便和土壤中存活11个月，对热较敏感，60℃30 min，80℃1～5 min可杀死。3%～5%苯酚、3%来苏儿、3%福甲醛，10%～20%漂白粉可杀灭本菌。
4.3到目前为止，副结核病没有特效疗法，但从药敏实验结果来看，此副结核杆菌对环丙沙星和卡那霉素敏感，对头孢呋肟中度敏感，对其他药物均产生不同程度的耐药性。所以环丙沙星、卡那霉素和头孢呋辛对羊副结核病有一定的疗效和治疗意义。
4.4在免疫方面没有有效的免疫疫苗，该病在治疗方面没有有效的治疗方法，曾试用链霉素，异烟肼进行治疗，效果不理想。对污染畜群每年要进行检疫（变态反应，补体结合反应，ELISA进行普检），阳性病畜隔离，淘汰。污染场地进行消毒，其粪便应堆积发酵。
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