基因组学与心力衰竭

一、基因组学

基因组（Genome）是1924年提出用于描述生物的全部基因和染色体组成的概念。1986年由美国科学家ThomasRoderick提出的基因组学（Genomics）是指对所有基因进行基因组作图（包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱），核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一门科学。1980年，噬菌体Φ-X174（5，368碱基对）完全测序，成为第一个测定的基因组。1995年，嗜血流感菌（Haemophilus influenzae，1.8Mb）测序完成，是第一个测定的自由生活物种。从这时起，基因组测序工作迅速展开。2001年，人类基因组计划公布了人类基因组草图，为基因组学研究揭开新的一页。自从1990年人类基因组计划实施以来，基因组学发生了翻天覆地的变化，已发展成了一门生命科学的前沿和热点领域。

从Griffith和Avery证明了基因的本质是DNA，基因是DNA分子上的功能单位，Watson和克里克Crick提出DNA双螺旋结构模型开始，将特定的基因定位于染色体的特定部位，并把组成基因的全部核苷酸序列测定出来（DNA全序测定）就成为最诱人的研究内容。染色体不能直接用来测序，故第一步必须将基因组这一巨大的研究对象进行分解，使之成为较易操作的小的结构区域，这个过程就是基因作图。

基因组研究包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学（structural genom-ics）和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学（functional genomics），又被称为后基因组（postge-nome）研究，成为系统生物学的重要方法。根据使用的标志和手段不同，作图有3张，即构建生物体基因组高分辨率的遗传图、物理图、转录本图，一个生物体基因组的最终图就是它的全部DNA序列。

1.基因组单核苷酸多态性及其应用

在DNA双螺旋结构发现50周年之际，人类基因组计划（human genome project，HGP）顺利完成。但基因组序列图侧重于人类基因的共性。只是反映了基因组稳定的一面，并未反映其变异或多态的一面，而正是这种基因组的多态性，即基因组序列的差异构成了不同个体与群体对疾病的易感性、对药物与环境因子不同反应的遗传学基础。因此，随着基因组序列图谱的绘制成功，研究人类基因组的多态性也就成为必然。人类基因组中的多态性，最简单、最多见的形式就是发生在基因组中的单个核苷酸变异，即单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms， SNPs），是人类基因组DNA序列变异的主要形式。

SNPs是一种可遗传的变异，是指基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基，其中最少一种在群体中的出现频率不小于1%。组成DNA的碱基虽然有4种，但SNPs通常是一种二等位基因的，即二态的遗传变异。SNPs作为一种碱基的置换，大多数为转换，即一种嘌呤碱基换为另一种嘌呤碱基或一种嘧啶碱基换为另一种嘧啶碱基，而颠换较少，转换：颠换之比约为2∶1。广义的SNsP还包括碱基的插入缺失等形式。研究发现，SNPs在CG序列上出现最为频繁，约占全部SNPs的25%，而且多是C—T，其原因是CG序列是人类基因组中最易发生突变的位点，其中的C常为甲基化的、可自发地脱氨后生成T。SNsP在人类基因组中广泛存在。据估计，在人类基因组中（约3.2×109bp）每千个碱基就有1个SNP，因此其总数将超过300万。SNPs可分为基因编码区SNPs（c SNPs）、基因调控区SNPs（p SNPs）和存在于连接两个基因之间的DNA中的随机非编码区的SNPs（r SNPs）三类。研究表明，c SNPs的数量远远低于非编码区的SNPs，这可能与编码区表达序列承受较大的选择压力有关。据报道，人类基因组有25万～40万个c SNPs，其中20%～30%的非同义c SNPs会引起编码蛋白质功能的改变，而位于基因调控序列中的SNPs则会影响基因表达量的多少，故这两类SNPs在功能或致病方面具有更重要的意义。虽然SNPs只有两种等位基因型，在个体中的多态信息量比目前常用的微卫星标记等多等位型少，但就整体而论，SNP的高密度分布使其多态性要高得多。由于SNPs的二态性，非此即彼，在基因组筛选中SNPs往往只需+/-的分析，无需象检测限制性片段长度多态性及微卫星多态性标记那样进行片段长度的测量，这就易于进行自动化批量检测。另外，SNPs还具有更高的遗传稳定性。因此，SNPs被普遍认为是继第一代限制性片段长度多态性标记、第二代微卫星即简短串联重复标记之后的第三代基因遗传标记。

心血管疾病、癌症、肥胖、糖尿病、精神病等常见病都是由多个基因与环境共同作用的结果。运用人类基因组的SNPs与单体型信息来挖掘这些常见病的遗传因素将使人们对人类疾病的发病机理，诊断和治疗产生全新的认识。连锁分析已经成功定位了许多单基因疾病的遗传变异，然而在定位影响常见复杂疾病的遗传变异时连锁分析往往是失败的，这些遗传变异影响着个体的疾病风险。寻找遗传疾病风险因子的一个补充方法就是通过比较患病组与未患病的对照组来寻找遗传变异与疾病之间的相关。SNPs是人体DNA序列变异最普遍的形式，单体型与单体域的构建使我们可以用很少的标签SNPs来代表全部的SNPs或整个基因或染色体的单体型来进行相关的研究应用。通过基因组的标签SNPs与复杂性疾病或药物反应的相关分析，可以揭示复杂性疾病的致病机理与疾病的不同临床表型，也可作为实行个体化治疗的根据。通过对候选基因或相关区域的单个或多个SNPs或单体型与复杂性状的关联分析寻找复杂疾病风险的遗传因素已经有很多报道。已有的研究表明：编码蛋白激酶AKT2/PKB β中一个单核苷酸的变化导致酶的活性变化，从而引起糖尿病。对于更多的复杂疾病，往往是由多个突变位点共同影响和决定的。

除了用于常见复杂疾病及患病风险的关联分析，SNPs与单体型还可以应用到药物基因组的研究中。药物基因学（Pharmacogenom ics）就是研究遗传变异如何影响个人对药物反应的不同的科学。β2肾上腺素受体基因上13个SNPs所形成的不同单体型间，哮喘病治疗药物的药物反应显著相关，这个研究就是SNPs在药物基因组学中应用的典型例子。通过SNPs与药物反应的相关分析能够显示出在不同个体的药物作用目标或药物代谢途径中的某个酶的差异，揭示个体的基因组多态与疾病治疗药物反应之间的关系。这就让我们可以预测出哪种药或疫苗对那些携带特殊基因型的个人最有效，让医师做到对人下药，增加临床试验的成功率。此外，对基因组多态与药物反应研究将促进个人化药物的开发。

2.基因组学与心力衰竭

（1）神经内分泌系统

目前相关研究表明，肾上腺素和肾素-血管紧张素-醛固酮系统通路的功能基因变异可能对该病的进展和治疗反应起重要的调节作用。β-AR属于G蛋白耦联受体超家族，是β受体拮抗剂最主要的心肌靶点，人类β-AR有β1、β2和β33种亚型，在心脏中的分布以β1-AR和β2-AR为主。目前已发现18个β1-AR多态性位点和9个β2-AR多态性位点，其中研究较多的分别为β1-AR的Ser49 Gly和Gly389 Arg，β2-AR的Arg16 Gly和Gln27 Glu。β1肾上腺素受体是心肌中主要的β肾上腺素受体亚型，它调节儿茶酚胺对心肌的变时、变力和变舒效应，许多候选基因研究表明，该受体基因多态性可影响心力衰竭的患病风险和疾病进展。β1-AR基因第145位碱基A突变为G导致受体蛋白第49位氨基酸Ser突变为Gly，该突变的发生率较低，G等位基因的突变频率在高加索人中为12%～16%，亚洲人中为15%，非洲裔美国人中为13%～15%，拉丁美洲裔西班牙人中为20%～21%。细胞研究显示，G1y49型受体是一种固有激活型受体，其基础及激活后的腺苷酸环化酶活性均高于Ser49型。人体持续给予β受体激动剂可引起β受体的数目、活性下调，导致对类似药物的敏感性降低。对β1-AR用异丙肾上腺素刺激20min后， G1y49型较Ser49型更易脱敏。同时Gly49型受体对具有反向激活能力的拮抗剂如美托洛尔，也更为敏感。Gly49携带者服药后，左室舒张末容积减小较Ser49携带者显著。Magnusson的研究显示，Gly49基因型的慢性心力衰竭患者采用低剂量的β受体拮抗剂治疗时，5年病死率更低，但这一差异在采用高剂量的β受体拮抗剂治疗时并不显著，提示临床上，对Gly49基因型扩张性心肌病患者可减少β受体拮抗剂的给药量。β1-AR基因第1165位碱基G突变为C导致受体蛋白第389位氨基酸Gly突变为Arg，C等位基因的突变频率在高加索人中为24%～34%，亚洲人中为20%～30%，非洲裔美国人中为39%～46%，拉丁美洲裔西班牙人中为31%～33%。病理生理学研究表明，β1受体Arg389等位基因会使腺苷酸环化酶活性增强、心肌变力效应加强及对β受体阻滞剂敏感性增高，相反β1受体Arg389等位基因会降低变力效应及对β受体阻滞剂的敏感性。有研究显示，患严重心力衰竭的Arg389纯合子患者较Gly389纯合子患者峰值耗氧量高。同时，Arg389等位基因患者对β受体阻滞剂美托洛尔的敏感性更高，且用美托洛尔治疗3个月后左心室重构改善明显。但也有研究并未观察到心力衰竭时β1受体基因多态性的基因-药物相互作用。

β2肾上腺素受体主要存在于血管平滑肌中，目前大多数研究并未发现该基因多态性对心力衰竭患病风险有影响。但Liggett等研究发现，β2肾上腺素受体基因多态性Ile164/Thr164与心力衰竭患者生存率有关，Ile164/Thr164基因型心力衰竭患者1年生存率远低于Thr164/Thr164基因型患者。最近一项研究发现，在使用卡维地洛治疗的心力衰竭患者中，与存在其他联合基因多态性相比，有联合β1肾上腺素受体Arg389 Gly基因多态性和β2肾上腺素受体Gln27Glu基因多态性的患者病死率会升高2倍。

G蛋白耦联受体激酶（G protein-coupled receptor kinases，GRK）作用可以使心肌β肾上腺素受体表达下调和退敏感化，而存在GRK5a-Leu41多态性时可加速β肾上腺素受体的去敏感化，类似β受体阻滞剂的药理作用。一项涉及2000例的大型双中心研究发现，GRK5-Leu41多态性可能对心力衰竭的进展有保护作用，携带GRK5-Leu41等位基因的心力衰竭患者较GRK5-Gln41纯合子患者的生存率高。此外，还有研究发现，GRK5-Leu41多态性与左心室心尖球形综合征有关，该病被认为与慢性儿茶酚胺过量相关。

α2肾上腺素受体可以抑制交感神经突触前释放去甲肾上腺素，它的激活会引发负反馈机制阻断交感神经活动，这样儿茶酚胺的刺激就随之增强。这一机制会被α2肾上腺素受体基因缺失多态性阻断，因此联合β1肾上腺素受体Arg389基因多态性和α2肾上腺素受体基因缺失多态性可能会进一步增加肾上腺素的作用而引起心脏毒性。Small等描述了联合这两种受体基因多态性会显著增加心力衰竭的患病风险，但MERIT-心力衰竭的研究报道并没有发现这种现象。另外，一项小样本回顾性研究观察了在使用美托洛尔治疗心力衰竭患者这两种受体基因多态性对心功能的影响，结果显示，存在α2肾上腺素受体基因缺失多态性的Arg389纯合子患者LVEF改善最明显。ACE可催化血管紧张素Ⅰ（AngⅠ）转化为血管紧张素Ⅱ（AngⅡ），为ACEI的主要作用靶点。目前人类ACE基因最常见的突变为16内含子一段长287bp的Alu序列的插入（Insertion，Ⅰ）和缺失（Deletion，D）多态性，包括纯合型（DD型）、杂合子（ID型）和插入纯合型（Ⅱ型）3种基因型。2个缺失等位基因纯合子携带者血浆ACE水平最高，而两个插入等位基因纯合子携带者血浆ACE水平最低，杂合子血浆酶水平介于二者之间。目前被研究证实最多的是缺失等位基因纯合子基因型与心力衰竭的相关性，携带该纯合子基因型的患者不良事件风险增高。一些研究也证实，与其他基因型携带者比较，该纯合子基因型患者对ACE抑制剂和β受体阻滞剂的敏感性更高。此外还有研究发现，该纯合子基因型与左心室肥厚有关。但也有研究对以上结论提出了质疑。

（2）全基因组关联相关

全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）是使用高通量测序技术对大规模的群体DNA样本进行单核苷酸多态性等的遗传标记并分型，然后将它们与疾病尤其是复杂疾病和可测量指标相关联的研究方法，由于其最初并没有定位假设影响疾病的基因变异，所以可以发现新的基因变异位点。GWAS已经成功鉴定了许多复杂疾病的风险位点，但在心力衰竭上的发现却十分有限。心力衰竭最早的GWAS使用序列分辨率较低的基因芯片发现了一个相关SNPs位点，但它没有被独立证实且不是功能基因变异。2010年的两项心力衰竭GWAS在＞20000个研究对象中对＞2400000个SNPs进行检测发现，两个SNPs与心力衰竭疾病进展相关，分别涉及USP3和LRIG3基因，另一个与心力衰竭死亡率相关的SNPs位于CMTM7基因上，这些SNPs的OR值都在1.5左右。亚基因组关联研究是将候选基因研究方法和GWAS结合，可以同时对众多感兴趣的基因位点进行评估，且避免了传统GWAS方法忽视疾病已建立的病理生理学基础缺陷。Cappola等在4700例研究对象中对2000个优选的心血管疾病相关基因进行了SNPs检测，发现了两个变异位点在HSPB7和FRMD4B基因上。由于重测序后并没有在HSPB7基因上发现功能SNPs，且该基因与CLCNKA基因存在连锁不平衡关系，Cappola等又对CLCNKA基因进行了重测序，发现了一个错义变异Arg83 Gly与心力衰竭显著相关。以上研究针对所有心力衰竭患者，而现在却越来越多的研究仅关注该病的某种类型。如欧洲一项扩张型心肌病的研究发现了3个扩张型心肌病相关SNPs，其中rs10927875被定位到包含许多基因（包括HSPB7基因）的染色体1p36.13区域，非同义SNPrs2234962被定位到含有BAG3基因的染色体10q26区域。该研究还在BAG3基因上发现了与家族性扩张型心肌病相关的罕见变异位点。另外，许多研究为了解心力衰竭病理生理学特点的某个方面，还将关注点放在一项或几项临床指标上。如有些研究仅观察超声心动图指标，发现3个有差异的位点与室间隔厚度相关，5个位点与主动脉根部内径相关，同时还发现了16个可疑位点。

（3）其他因素

尽管大多数基因变异不致病，但那些可以改变编码蛋白的氨基酸序列、mRNA前体剪接或mRNA表达水平的变异都有致病的风险。目前已发现可以改变转录后mRNA前体加工过程的SNPs与心脏疾病有相关关系。心脏钠通道基因SCN5A、肌联蛋白基因、基质网钙ATP酶基因SERCA，脑利钠肽基因和肌钙蛋白T及其他肌小节基因变异对RNA剪接的调节都已在人类心力衰竭中被发现。另外值得注意的是，治疗心力衰竭的药物地高辛的药理作用也是改变了RNA的剪接过程，这就说明一些病理性剪接过程可能成为药物治疗的靶点。DNA拷贝数变异可以通过对基因的重排改变一个或多个基因的表达水平，但目前研究发现，DNA拷贝数变异只调节一小部分基因表达水平的变化，这可能与人们对基因-剂量机制的理解有限有关。到目前为止，还没有GWAS证实DNA拷贝数变异与心力衰竭有关，但已有候选基因研究发现，MYB-PC3基因缺失多态性与该病相关。表观遗传变异是指基因表达发生改变，但不涉及DNA序列的变化，它也能在代与代之间传递，包括DNA的甲基化、组蛋白的修饰和非编码RNA，如mi R-NA的调节等。DNA甲基化已在人类心力衰竭中被发现，未来在全基因组水平鉴定DNA甲基化可以使人们进一步了解它对心力衰竭的影响。组蛋白的修饰包括乙酰化、甲基化和其他能通过释放DNA-组蛋白结合体来松解压缩的DNA的过程，目前已有研究发现，可逆的组蛋白乙酰化/去乙酰化作用可以调节心肌肥厚。最后miRNA可调节mRNA的稳定性和翻译过程，从而对心力衰竭等心血管疾病中的表达变化出现影响。