口蹄疫常用检测方法

3.10　口蹄疫常用检测方法

3.10.1　口蹄疫非结构蛋白间接酶联免疫吸附试验（FMD 3ABC-I-ELISA）

1.用途　FMD 3ABC-I-ELISA试剂盒（中国农业科学院兰州兽医研究所生产）检测FMDV非结构蛋白3ABC抗体。该试剂盒不受血清型影响，适用于活畜进出口调运、疫区净化检疫和群体无症状感染评价，区分感染和免疫动物。本诊断试剂盒可测出牛感染后长达480天（16个月）的FMDV感染抗体。

2.原理　FMD 3ABC-I-ELISA试剂盒采用间接ELISA模式。用3ABC基因表达蛋白包被ELISA板，洗板封闭。加入待检血清样品，如果血清样品中有3ABC抗体，与ELISA板上3ABC蛋白结合，形成抗原-抗体复合物，再与酶标二抗结合，加入底物后，就会出现颜色反应。如果待检样品为阴性，就不能形成抗原-抗体复合物，酶标二抗不会结合，因此就不显色。

3.注意事项　冰冻血清样品应充分融化，且应混合均匀。

血清稀释液和底物应平衡至室温应用。底物A在4℃为结晶状态，需要在室温或37℃水浴状态溶解后应用。最好在血清稀释板上稀释血清，以减少操作误差。

应使用相同的加样器加样，以保证加样量的准确，减少试验误差。

多道微量移液器所用的吸头应为同一规格和型号，避免加样误差。

应使用自动或手动连续洗板系统洗板。

加样先后次序应该一致，保证作用时间一样。

底物作用时间到后，如果颜色较浅，可适当延长作用时间。

4.试剂准备　将试剂盒配备的25倍浓缩PBST用无离子水或蒸馏水做1:25倍稀释即可。

5.操作步骤

一是待检血清样品和阳性、阴性对照血清用血清稀释液1:21稀释（120μl血清稀释液加血清6μl），每孔加入100μl，阴、阳性对照血清样品平行加两孔，用封口膜封口，37℃结合30分钟。

二是取掉封口膜，每孔加满洗涤液，洗涤5次，最后一次拍干。

三是用血清稀释液按1:1000稀释酶标二抗，每孔加入100μl，用封口膜封口，37℃结合30分钟。

四是取掉封口膜，每孔加满洗涤液，洗涤5次，最后一次拍干。

五是将底物A按1:50比例（体积比）稀释于底物B中（1毫升底物B中加入20μl底物A），吹打混匀，每孔加入100μl，封口膜封口，37℃避光作用10～15分钟。

六是每孔加入100μl终止液。

七是轻轻摇振混匀，测定波长450nm吸光值（OD450值）。

八是阳性对照平均OD值应大于0.6，阴性对照平均OD值应小于0.2。

九是结果计算。样品效价为（OD样品-OD阴性）/（阳性-OD阴性）。

6.结果判定若效价＜0.2，为阴性；效价在0.2～0.3之间为可疑；效价＞0.3为阳性。可疑和阳性样品应进行复测，复测为可疑和阳性时，应判为阳性。

3.10.2　口蹄疫抗体液相阻断酶联免疫吸附试验（LB-ELISA）

1.原理　口蹄疫抗体液相阻断酶联免疫吸附试验（LB-ELISA）诊断试剂盒（中国农业科学院兰州兽医研究所生产）是将预先滴定好的固定量病毒抗原与被检血清首先在液相中反应，然后将抗原抗体复合物转移到包被了FMD型特异性抗体的ELISA板中，没有完全被血清抗体阻断的病毒抗原被ELISA板中的抗体捕获，亦与随后加入的豚鼠抗血清中的抗体结合，再通过兔抗豚鼠IgG酶结合物和底物溶液显色。按试验孔呈现的颜色与抗原对照（未加血清）孔呈现颜色相比较判定结果。抗体滴度以能阻断50%病毒抗原的血清稀释度表示。口蹄疫液相阻断ELISA诊断试剂盒液相阻断ELISA是国际兽疫局（OIE）推荐的检测口蹄疫病毒抗体的标准方法。

2.试剂与器材

试剂

捕获抗体：兔抗口蹄疫病毒146S血清

检测抗体：豚鼠抗口蹄疫病毒146S血清

病毒抗原及病毒对照抗原：用BEI灭活的病毒细胞培养物

标准阳性血清和阴性血清

酶结合物：兔抗豚鼠IgG-辣根过氧化物酶结合物

底物溶液：邻苯二胺（OPD）/H₂O₂溶液

终止液：1.25mol/L H₂SO₄

缓冲液：

包被缓冲液：0.05M Na₂CO₃/NaHCO₃，pH9.6

稀释液：0.05%（V/V）Tween-20加入0.01M PBS,pH7.4（PBST）

豚鼠抗血清稀释液：10%牛血清-5%兔血清-PBST

洗涤液：0.01M PBST,pH7.4

仪器材料

ELISA板：96孔平底聚苯乙烯ELISA板

抗原抗体反应板：96孔U型底聚苯乙烯微量板

移液器：0.5～20μl，5～40μl，50～200μl，200～1000μl可调移液器各一把，8道或12道移液器1把，移液槽5～6个，配套移液枪尖若干。

生化培养箱1个

酶标仪：492nm波长滤光片

吸水纸巾

3.操作步骤

（1）在U型血凝板上按50μl/孔量用PBST工作液将待检血清从1:4开始做2倍稀释至1:512。然后每孔加入50μl用PBST稀释到使用浓度（1:5）的病毒抗原，震荡混匀，4℃过夜。加入病毒抗原后血清的实际稀释度变为从1:8开始的2倍连续稀释度。

（2）将血清-抗原复合物移入ELISA板内，每孔50μl，37℃，60分钟温浴。

（3）用PBST洗板5次。每孔加50μl用豚鼠抗血清稀释液稀释至使用浓度（1:1600）的豚鼠抗血清，37℃，60分钟温浴。

（4）用PBST洗板5次，每孔加50μl用PBST稀释至使用浓度（1:2000）的兔抗豚鼠IgG-辣根过氧化物酶结合物，37℃，60分钟温浴。

（5）用PBST洗板5次，每孔加50μl邻苯二胺（OPD）/H₂O₂溶液，37℃，15分钟温浴后，每孔再加入50μl终止液终止反应，以492nm波长测定OD值。

4.对照的设立与结果的判定

一是标准阳性、阴性血清对照：用标准阳性血清替代待检血清进行上述试验，OD值应随着稀释度的增加而有规律地升高，以显示试验系统的准确性。阳性血清滴度1:2048±1个滴度、阴性血清滴度小于1:4成立。

二是病毒抗原对照：每次试验每块板设4孔用PBST稀释至使用浓度（1:5）的病毒抗原对照，不加待检血清，其他步骤完全同上述程序。病毒抗原对照至少2孔的OD值在1.0～1.5时，试验成立。

三是结果判定：以病毒抗原对照平均OD值的50%为临界值，被检血清OD值大于临界值的孔为阴性孔，小于临界值的为阳性孔，阳性孔的OD值等于临界值时所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度。如果病毒抗原对照平均OD值为1.2，则其50%为0.6。若一待检血清在1:128时OD值为0.6，则该份待检血清的抗体滴度为1:128。抗体滴度＜16阴性，＞32阳性，16～32可疑。ELISA抗体滴度与免疫动物攻毒保护的关系：牛、羊≥1:128 100%保护，＜16不保护，22～90 50%保护。