3.11 口蹄疫正向间接血凝（PHA）和反向间接血凝（RPHA）试验
3.11.1 用途
PHA试验主要用于检测口蹄疫（FMD）免疫动物血清抗体效价，也可用于口蹄疫血清学调查。RPHA试验主要用于检测FMD病毒，用于FMD诊断和病原监测。
3.11.2 原理
在PHA试验中，经过FMD抗原致敏红细胞与FMD抗体相遇，红细胞出现清晰的凝集现象。根据出现凝集滴度，判定待检血清效价。在RPHA试验中，经过FMD抗体致敏的红细胞与FMD抗原相遇，出现清晰的凝集现象。根据是否出现凝集，判定待检样品是否含有FMD病毒。
3.11.3 口蹄疫正向间接血凝试验（PHA）
1.试验器材
96孔1100V型医用血凝板，与血凝板大小相同的玻板
微量移液器（50μl/25μl）、移液塑料嘴
微量振荡器
口蹄疫血凝抗原
口蹄疫阴性对照血清
口蹄疫阳性对照血清
稀释液
待检血清（每头约0.5毫升即可）
2.试验方法
加稀释液，在血凝板上1～6排的1～9孔；第7排的1～4孔，第8排的1～12孔各加稀释液50μl。
稀释待检血清，取1号待检血清50μl加入第1排第1孔，并将塑嘴插入孔底，右手拇指轻压弹簧1～2次混匀（避免产生过多的气泡）从该孔取出50μl移入第2孔，混匀后取出50μl移入第3孔……直至第9空混匀后取出50μl丢弃。此时第1排1～9孔待检血清的稀释度（稀释倍数）依次为1:2/1:4/1:8/1:16/1:32/1:64/1:128/1:256/1:512。取2号血清加入第2排，取3号血清加入第3排……均按上述方法稀释。要注意的是每取1份血清时，必须更换塑嘴1个。
3.稀释阴性对照血清
在血凝板的第7排第1孔加阴性血清50μl，加倍稀释至第4孔，混匀后从该孔取出50μl丢弃。此时阴性血清的稀释倍数依次为1:2/1:4/1:8/1:16。第6孔为稀释液对照。
4.稀释阳性对照血清
在血凝板的第8排第1孔加阳性血清50μl，对倍稀释至第12孔，混匀后从该孔取出50μl丢弃。此时阳性血清的稀释倍数依次为1:2～1:4。
5.加血凝抗原
被检血清各孔、阴性对照血清各孔、阳性对照血清各孔、稀释液对照孔各加血凝抗原（充分摇匀，瓶底应无血球沉淀）25μl。
6.振荡混匀
将血凝板置于微量振荡器上振荡1～2分钟，如无振荡器，用手轻轻摇匀亦可，然后将血凝板放在白纸上观察各孔红血球是否混匀，不出现血球沉淀为合格。盖上玻板，室温下或37℃下静置1.5～2小时判定结果，也可延至翌日判定。
7.判定标准
一是移去玻板，将血凝板放在白纸上，先观察阴性对照血清1:16孔，稀释液对照孔，均应无凝集（血球全部沉入孔底形成边缘整齐的小圆点）或仅出现“+”凝集（血球大部沉于孔底，边缘稍有少量血球悬浮）。
二是阳性血清对照1:2—1:256各孔应出现“++—++++”凝集为合格（少量血球沉入孔底，大部分血球悬浮于孔内）。
三是在对照孔合格的前提下，再观察待检血清各孔，以呈现“++”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。例如1号待检血清1～5孔呈现“++—++++”凝集，6～7孔呈现“++”凝集，第8孔呈现“+”凝集，第9孔无凝集，那么就可判定该份血清的口蹄疫抗体效价为1:128。
8.检测试剂的性能
性状
液体血凝抗原：摇匀呈棕红色或咖啡色静置后血球逐渐沉入瓶底。
阴性对照血清：淡黄色清亮稍带黏性的液体。
阳性对照血清：微红或淡黄色稍浑浊带黏性的液体。
稀释液：淡黄或无色透明液体，低温下放置，瓶底易析出少量结晶，在水浴中加温后即可全溶，不影响使用。
包装
液体血凝抗原：摇匀即可使用，5毫升/瓶，每瓶检测25～30头份血清。
阴性血清：1毫升/瓶，直接稀释使用。
阳性血清：1毫升/瓶，直接稀释使用。
稀释液：100毫升/瓶，直接使用，4～8℃保存。
保存条件及保存期
液体血凝抗原：4～8℃保存，（切勿冻结）保存期3个月。
阴性对照血清：-15℃～-20℃保存，有效期1年。
阳性对照血清：-15℃～-20℃保存，有效期1年。
9.注意事项
一是严重溶血或严重污染的血清样品不宜检测，以免发生非特异性反应。
二是勿用900和1300血凝板，严禁使用一次性血凝板，以免误判结果。
三是用过的血凝板应及时在水龙头下冲净血球。再用蒸馏水或去离子水冲洗2次，甩干水分放37℃恒温箱内干燥备用。检测用具应煮沸消毒，37℃干燥备用。血凝板太脏，可浸泡在5%盐酸内，48小时捞出后清水冲净。
每次检测只做一份阴性、阳性和稀释液对照。
3.11.4 反向间接血凝试验（RPHA）
1.样品的采集
水泡皮：采集牛舌部、乳房部和蹄叉、蹄冠或鼻镜部的新鲜、成熟、未破裂水泡皮5～10g，装于消毒的玻璃瓶内。注意：不要采集腐败、溃疡的皮痂等表皮组织。
水泡液：用消毒注射器吸取牛发病部位未破裂的水泡液1～5毫升，装于灭菌瓶内。
2.样品保存与运输
在水泡皮中，加50%甘油生理盐水，放置于-20℃的冰箱保存；水泡液中加青霉素（1×10U/毫升）和链霉素（0.5×10U/毫升），不加保存液，冷冻保存。装病料的瓶子用蜡封口，低温专人运送或航空寄到鉴定单位实验室。
注意：在运送的过程中一定要小心谨慎，防止沿途散毒。
3.实验室检测材料
敏化红细胞诊断液、稀释液及标准抗原；
研钵或组织研磨器、离心机、96孔微型聚苯乙烯血凝滴定板（1300，V型）、微量加样移液器、塑料滴头、微量振荡器；
0.01mol/L PBS缓冲液（NaCl 8.0克；KCl 0.2克；KH2PO40.2克；Na2HPO41.15克；双蒸水1000毫升；pH7.2）。
4.操作方法
病料处理将水泡皮用0.01mol/L PBS缓冲液洗2～3次，用消毒滤纸洗去水分，称重；将病料加少量的0.01mol/L PBS缓冲液于研钵或组织研磨器中研磨，最终加0.01mol/L PBS缓冲液配成1:5（W/V）的悬液，放室温静置1小时或4℃冰箱中过夜；最后用离心机3000～5000r/分钟离心20～30分钟，取上清液。水泡液则不需作任何处理，即可用来直接检测。
待检抗原的稀释试管架上摆放试管8只，自第1管开始由左至右用稀释液进行对倍稀释（即1:6，1:12，1:24……1:768），每管体积为0.5毫升即可。
反应①滴加待检抗原：取96孔微型血凝板，在第1～5排的第8孔滴加第8管稀释抗原50μl，每排的第7孔滴加第7管稀释抗原50μl，依次类推至第1孔，每排的第9孔滴加稀释液50μl，作为阴性对照，每排的第10孔按顺序分别滴加A、O、C、ZB、水泡病5种标准抗原（1:30稀释）各50μl，作为阳性对照（注意每型换滴头1支）。
②滴加红细胞诊断液：用前将红细胞诊断液摇匀，于微型板第1～5排每孔分别滴加A、O、C、ZB及水泡病红细胞诊断液25μl，轻轻振荡微型板，使红细胞均匀分布。室温放置1.5～2小时后判定结果。
5.结果判定
判断标准按以下标准判定红细胞凝集程度。
“++++”——完全凝集；
“+++”——75%凝集；
“++”——50%凝集；
“+”——25%凝集；
“-”——不凝集。
观察微型板上各孔的凝集图形。假如只第1排孔凝集，且阴性对照孔不凝集（阴性）；阳性对照孔凝集（阳性），其余4排孔不凝集，则证明此种凝集是与A型红细胞诊断液同型病毒所致的特异性凝集，待检抗原既判为A型，若只第2孔凝集，其余4排孔不凝集，则待检抗原判为O型，以次类推。
致敏红细胞凝集（凝集图形为++以上者）的抗原最高稀释度为凝集效价。
某排孔的凝集效价高于其余排孔的凝集效价2个对数（以2为底）滴度以上者即可判为阳性。
6.红细胞诊断液的保存及活力检查
标准抗原作1:10稀释（实际浓度为1:30），然后进行对倍稀释（实际浓度即为1:60、1:120，……1:3840）。
稀释的标准抗原依次滴加于微型板上，然后滴加红细胞诊断液。测定其活力。
红细胞诊断液一般可保存5个月左右。每1～2个月检查活力一次，当活力低于1:60时停止使用。
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