4.9 副结核病血清学ELISA法诊断（法国Institut Pourquier）
在副结核病血清学诊断中，ELISA是最敏感、最具特异性的方法。它对临床病例的敏感性相似于补体结合试验，并且对无临床表现的动物的检测敏感性更高，可以在临床表现前6～9个月时诊断出该病。
在微量滴定孔底部包埋的抗原是副结核分枝杆菌的原生质提取液。为了消除其他非典型分枝杆菌的交叉感染，要用含有分枝杆菌提取液的样品温浴。ELISA检测方法是特异性的、快速的、可实施的、廉价的、易自动化的检测技术。
该试剂盒可用于牛、绵羊、山羊的血清或血浆样品进行血清学诊断，也适合于牛奶样品。当用该试剂盒检测混合的罐装牛奶样品时，只适合检测高感染群。
4.9.1 试验原理
M型副结核杆菌抗原被包埋在聚苯乙烯板上的微孔里。
为了消除交叉反应，用含有分枝杆菌提取液的稀释液稀释并温浴。
把温浴后的样品直接加入到微量滴定板的微量滴定孔里，如果样品中含有M型副结核杆菌特异性抗体，会形成M型副结核抗原-抗体复合物，被吸附在微孔壁上。
洗涤后，在微孔中加入抗反刍动物酶联免疫球蛋白，并温浴。此连接物便结合到抗原-抗体免疫复合物上。
再次洗涤后，微孔中加入酶底物，若酶联连接物被吸附，酶将底物由蓝色转变为黄色。通过颜色的强度检测待检血清中抗体水平。
注意：每板必须有阳性对照组，由此判断检测效应。
4.9.2 使用注意事项
在加试剂或检验样品时，不要把移液管放入嘴里。
避免酶底物触到皮肤、黏膜和眼睛。
终止液中含有硫酸，可能会引起严重的烧伤。
试剂盒中的物品无感染性，但来自动物的血清应当被认为有潜在的感染性，建议检测程序完成后，使用的物品在丢弃前，至少用5%的次亚氯酸钠浸泡1小时，或在120℃高温高压下处理1小时。
建议：试剂盒中所有试剂（除了酶标记接合物和对照血清外）拿出来在室温21±5℃下预热1小时以上。
4.9.3 试剂盒中不包含的其他所需物品
微板读数机（酶标仪）
离心机
微量离心管
漩涡机或振荡器
能够每孔里分配300μl洗涤液的微量滴定板洗涤系统（洗板机）
精确的微量移液器及多道微量移液器（精确度应该小于或等于最小容量的10%或等于10μl，并小于或等于其他容量的5%）
各种移液器移液嘴
蒸馏水：用于处理对照血清和浓缩洗涤液的水，可以是常规蒸馏水或其他高性能纯净水
微量滴定板覆盖物（盖子、铝箔片或覆盖物）
4.9.4 使用说明
1.用分枝杆菌液处理待检样品
在微量离心管或溶血管里，把对照血清、待检血清或血浆按1/20稀释在稀释液12里。乳液样品按1/2稀释在稀释液12里。摇一摇，并在21±5℃温浴15分钟。温浴时间可延长到2小时。
2.样品处理
分配见表4-2。
把100μl被稀释的阴性对照加于A1孔里。
把100μl被稀释的阳性对照加于B1、C1孔里。
把100μl被稀释的待检样加于每孔里（一个待检样一个孔）
通过细致地摇动微量滴定板，混匀微量滴定孔里的内容物
盖上盖子，在21±5℃温浴1小时±5分钟或在5±3℃过夜。
3.洗涤
每瓶浓缩洗涤液需要用1900毫升的蒸馏水稀释（稀释20倍），稀释后的溶液称为“洗涤液”。1瓶原液（100毫升）在全部用完的情况下，有结晶，5±3℃也可以稀释（只需稀释部分溶液则必须等结晶全部溶解）。
用“敲打法”或其他更好的手工或自动方法把微量滴定孔中的液体排空。
每孔中加入洗涤液，再次排空。
重复洗涤步骤两次（共洗3次）。
要求：在检测乳液样品时，强烈推荐把洗涤液留在微孔里2分钟，这会大大降低背景干扰；同时处理几个微量滴定板时（为了使所有的步骤同步化），只要在一个小时之内加“洗涤液”不改变检测的有效性。
4.酶标连接物的稀释、分配
酶标连接物的稀释要依据样本温浴的模式而定。如果处理短时间温浴的样品（21±5℃温浴1小时的样品）时，用稀释缓冲液1把酶标连接物按1:100的比例稀释，然后每孔里加100μl的该稀释液。处理长时间温浴样品（在5±3℃温浴过夜的样品）时，用稀释缓冲液1按1:200的比例稀释酶标连接物，每孔里加入100μl的该稀释液。
盖上盖子（自带的盖子或铝箔片），在21±5℃温浴30±5分钟。
5.洗涤
用敲打法或其他方法排空微量滴定孔里的溶液。
所有的孔里加满洗涤液，再排空。
重复步骤2次（共洗3次）。
要求：在检测乳液样时，强烈推荐把洗涤液留在微孔里2分钟，这样会大大降低背景干扰。最后的洗涤对检测结果的好坏很重要，要认真操作。要是手工处理，最后一次洗涤后，把微板在吸水纸上轻拍，吸尽孔中的残留液。
6.显色
每孔里加入100μl的待用显色液5。
在21±5℃温浴20分钟（避光）。
每孔加入100μl终止液。
轻轻地摇动微量滴定板，使有色溶液混匀，并认真地轻擦微板底部。
注意：①在以上方法中提到的20分钟显色时间，在我们实验室里，能提供确认标准范围内的OD值。然而，不同的因素（洗涤的质量、所用水的质量、加样的准确度、反应的温度等）会轻微地改变显色效率。因为上述原因，用此方法得到的显色结果，OD值可能会比期望值高或低，在这种情况下，此反应可在10～30分钟内终止。②在黑暗中保存微板的情况下，可在反应后1小时内读取数据。
7.读取数据
读取450nm时的光密度（OD450），微板读数机计必须先校正。有效性确认标准，在以下情况下，认为检测结果有效：阳性对照最小平均OD450值是0.350；阳性对照平均OD450值和阴性对照平均OD450值的比率大于等于3。
4.9.5 结果的判断
每个样品S/P百分数的估计
来自动物的血样，其S/P（%）≤60%时，被认为没被副结核分枝杆菌感染来；其S/P（%）在60%～70%之间为可疑个体，需要做第二次检验来确定；其S/P（%）≥70%时，被认为已感染副结核分枝杆菌。
对于牛奶样的检测：其S/P（%）≤30%时，该样品被认为没被副结核分枝杆菌感染；其S/P（%）在30%～40%之间时，该样品为可疑个体，需要做第二次检验来确定；其S/P（%）≥40%时，被认为已感染副结核分枝杆菌。
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