7.8 牛传染性鼻气管炎（IBR）的ELISA血清学诊断（法国Insti-tut Pourquier）
7.8.1 试验原理
1.微量滴定板上的所有微量滴定孔被BHV-1的病毒抗原包被。
2.待检样品被稀释并在滴定孔中温浴。在样品血清中的任何BHV-1特异性抗体都形成BHV-1与抗体免疫复合物，被吸附在微量滴定孔的壁上。
3.洗涤后，在微量滴定孔中加入用酶标记的抗-牛抗体免疫球蛋白，该酶标连接物将结合到BHV-1与抗体免疫复合物上。
4.再次洗涤后，在微量滴定孔中加入酶底物（TMB），所形成的蓝色复合物在反应后变为黄色，颜色的强度反应样品中抗体的比率。
每个微量滴定板必须添加阳性对照，由此判断检测效应。
7.8.2 可检测性
该试剂盒适用于个体血清和乳样的分析。
该试剂盒的检测界限允许检测欧洲标准血清EU2。
试剂盒所包括物品及其保存
建议：试剂盒中所有试剂（除了酶标记接合物和对照血清外）拿出来在室温21±5℃下预热1小时以上。
7.8.3 使用注意事项
在加试剂或检验样品时，不要把移液管放入嘴里。
避免酶底物触到皮肤、黏膜和眼睛。
终止液中含有硫酸，可能会引起严重的烧伤。
试剂盒中的物品无感染性，但来自动物的血清应当被认为有潜在的感染性。建议检测程序完成后，使用的物品在丢弃前，用5%的次亚氯酸钠至少浸泡1小时，或在120℃高温高压处理1小时以上。
7.8.4 检测血清样品的操作规程
1.血清样品处理
用以下方法把血清（待检样和对照组）稀释成1/20
分配：
每孔里加190μl的稀释液2
A1孔里加10μl的阴性对照
B1、C1孔里加10μl的阳性对照
其他每孔里加入10μl的待检血清（每微孔只加一个样品）
通过精心地摇动微量滴定板，混匀微量滴定孔里的内容物（注释1）
盖上盖子，在37℃（±5℃）温浴1小时±5分钟。
使用该方法可在半天之内完成整个检测过程。
2.洗涤
每瓶浓缩洗涤液（×20）需要用1900毫升的蒸馏水稀释（稀释20倍），稀释后的溶液称为“洗涤液”。1瓶原液（100毫升）能全部用完的情况下，有结晶[5℃（±3℃）]也可以稀释（只需稀释部分溶液则必须等结晶全部溶解）。
b.用“敲打法”或其他更好的手工或自动方法把微量滴定孔中的液体排空。
c.每孔中加入洗涤液，再次排空。
d.重复步骤c两次（共洗3次）。
注释：同时处理几个微量滴定板时（为了使所有的步骤同步化），只要在一个小时之内加“洗涤液”不改变检测的有效性。
3.酶标连接物的稀释、分配
（1）用稀释液1把酶标连接物按1:100的比例稀释。
（2）每孔里加100μl的该稀释液。
（3）盖上盖子（自带的盖子或铝箔片），在37℃±5℃温浴30±3分钟。
4.洗涤
a.用敲打法或其他方法排空微量滴定孔里的溶液。
b.所有的孔里加满洗涤液，再排空。
c.重复步骤b 2次（共洗3次）。
5.显色
a.每孔里加入100μl的待用显色液3。
b.在21±5℃温浴20分钟（避光）。
c.每孔里加入100μl的终止液。
d.轻轻地摇动微量滴定板，使有色溶液混匀，并谨慎地轻擦微板底部。
6.读取数据
读取在450nm的光密度（OD450），光度计必须先校正。
（1）有效性确认标准 在以下情况下，认为检测结果有效：阳性对照最小平均OD450值应是0.350，并且阳性对照平均OD450值和阴性对照平均OD450值的比率大于等于3.5。
（2）血样检测结果的判读 每个样品S/P百分数的估计
S/P（%）≤45%的样品，其个体被认为没感染BHV-1。
S/P（%）在45%～55%的样品，其个体被认为是可疑的。
S/P（%）≥55%的样品，其个体被认为已感染BHV-1。
（3）注意 ①建议用其他方法来证实ELISA检测结果为可疑的血样。②活苗或灭活苗的使用都会引起显著的血清学反应。③产犊后的6个月内，可检测到初乳里的抗体。
7.8.5 检测乳液样品的操作规程
1.样品的处理
对照血样用以下方法把对照样稀释成1/20
分配：
每孔里加190μl的稀释液2
A1孔里加10μl没稀释的阴性对照液
B1、C1孔里加10μl没稀释的阳性对照液
用以下方法把待检乳液样稀释成1/2
分配：
每孔里加100μl的稀释液2
每孔里加100μl的待检乳液样（每孔里只加一个样）
2.样品的温浴
通过精心地摇动微量滴定板，混匀微量滴定孔里的内容物
盖上盖子，在37℃（±3℃）温浴1小时±5分钟。
使用该方法可在半天之内完成整个检测过程。
3.洗涤
a.每瓶浓缩（×20）洗涤液需要用1900毫升的蒸馏水稀释（稀释20倍），稀释后的溶液称为“洗涤液”。1瓶原液（100毫升）能全部用完的情况下，有结晶[5℃（±3℃）]也可以稀释（只需稀释部分溶液则必须等结晶全部溶解）。
b.用“敲打法”或其他更好的手工或自动方法把微量滴定孔中的液体排空。
c.每孔中加入洗涤液，再次排空。
d.重复步骤c两次（共洗3次）。
4.酶标连接物的稀释、分配
a.用稀释液1把酶标连接物按1:100的比例稀释。
b.每孔里加100μl的该稀释液。
c.盖上盖子（自带的盖子或铝箔片），在37℃±5℃温浴30±3分钟。
5.洗涤
a.用敲打法或其他方法排空微量滴定孔里的溶液。
b.所有的孔里加满洗涤液，再排空。
c.重复步骤b 2次（共洗3次）。
6.显色
a.每孔里加入100μl的待用显色液3。
b.在21±5℃温浴20分钟（避光）。
c.每孔里加入100μl的终止液。
d.轻轻地摇动微量滴定板，使有色溶液混匀，并谨慎地轻擦微板底部。
7.读取数据
读取在450nm的光密度（OD450），光度计必须先校正。
（1）有效性确认标准 在以下情况下，认为检测结果有效：阳性对照最小平均OD450值应是0.350，并且阳性对照平均OD450值和阴性对照平均OD450值的比率大于等于3.5。
（2）检测结果的判读 每个样品S/P百分数的估计
S/P（%）≤25%的样品，这一组动物被认为没感染BHV-1。
S/P（%）＞25%的样品，这一组动物被认为已感染BHV-1。
（3）注意 建议用其他方法来证实ELISA检测结果为可疑的血样；活苗或灭活苗的使用都会引起显著的血清学反应；产犊后的6个月内，可检测到初乳里的抗体。
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