10.8 牛病毒性腹泻—黏膜病（BVD-MD）血清学ELISA法诊断（法国Institut Pourquier）
10.8.1 检测原理
1.通过特异性单克隆抗体“WB103”，P80蛋白，包被于微量滴定板的微孔里。
2.待检样本稀释和温浴于微孔中，样本中的特异性抗体与P80形成抗体-P80复合体，P80蛋白被遮蔽。
3.洗涤后，在微孔中加入被过氧化物酶标记的单克隆抗体“WB112”（针对P80的另一个表位）并温浴。样本中若存在BVDV抗体，P80的结合位点被“遮蔽”，所以酶-单抗体连接物不能结合到相应的位点上，反而与P80结合。
4.洗涤后，在微孔中加入酶底物（TMB）。酶标-单抗连接物被吸附在微孔壁上，使酶底物颜色由蓝变为黄色。颜色的强度与待检样中的抗体比例成反比。
每块板中必须有有效的阴性作对照，由此判断效应。
10.8.2 使用注意事项
1.在加试剂或检验样品时，不要把移液管放入嘴里。
2.终止液中含有硫酸，可能会引起严重的烧伤。
3.试剂盒中的物品无感染性，但来自动物的血清应当被认为有潜在的感染性，建议检测程序完成后，使用的物品在丢弃前，用5%的次亚氯酸钠至少浸泡1小时，或在120℃高温高压下处理1小时以上。
10.8.3 试剂盒所包括物品及试剂的保存
推荐所有试剂使用温度为21℃（±5℃），所以建议在检测前拿出所有试剂（除了酶标记接合物和对照血清外）在室温21±5℃下预热1小时以上。
10.8.4 操作规程
1.样品的处理
分析个体血清或血浆时，使用者既可温浴1小时，也可温浴过夜，分析血清或血浆混合样时，必须采用过夜温浴方法。
（1）个体血清、血浆样的分析可使用两种温浴方法。
短时间温浴，在21℃（±5℃）下，温浴1小时。
用以下方法把血清（待检样和对照组）稀释成1/2（表10-1）。
分配：
每孔里加50μl的稀释液9
A1孔里加50μl没稀释的阴性对照液
B1、C1孔里加50μl没稀释的阳性对照液
其他每孔里加入50μl的待检血清（每微量滴定孔只加一个样品，A1、B1、C1孔里不加待检血清）
通过精心地摇动微量滴定板，混匀微量滴定孔里的内容物（注释1）
盖上盖子，在21℃（±5℃）温浴1小时±5分钟。
使用该方法可在半天之内完成整个检测过程。
低温长时间温浴：在5℃（±3℃）下，温浴过夜。
用以下方法把血清（待检样和对照组）稀释成1/10，并在5℃（±3℃）下，温浴过夜。
分配：
每孔里加90μl的稀释液9
A1孔里加10μl没稀释的阴性对照液
B1、C1孔里加10μl没稀释的阳性对照液
其他每孔里加入10μl的待检血清（每微量滴定孔只加一个样品，A1、B1、C1孔里不加待检血清）
通过精心地摇动微量滴定板，混匀微量滴定孔里的内容物
盖上盖子，在5℃（±3℃）温浴过夜。
（2）混合血清样的分析
用以下方法把血清（待检样和对照组）稀释成1/2，并在5℃（±3℃）下，温浴过夜（表10-2）。
分配：
每孔里加50μl的稀释液9
A1孔里加50μl没稀释的阴性对照液
B1、C1孔里加50μl没稀释的阳性对照液
其他每孔里加入50μl的待检血清（每微量滴定孔只加一个样品，A1、B1、C1孔里不加待检血清）
通过精心地摇动微量滴定板，混匀微量滴定孔里的内容物（注释1）
盖上盖子，在5℃（±3℃）温浴过夜。
（3）牛奶样的分析
使用者，可采用两种温浴方法。
短时间温浴，21℃温浴2小时。
分配：
A1孔里加入50μl的稀释液9和50μl没稀释的阴性对照液
B1、C1孔里加入50μl的稀释液9和50μl没稀释的阳性对照液
每孔里加入100μl的没稀释的牛奶样（每孔里只加一个样）
盖上盖子，在21℃（±5℃）温浴2小时±5分钟。长时间温浴（21℃温浴过夜）。
每孔里加100μl的稀释液9
分配（表10-2）：
A1孔里加100μl没稀释的阴性对照液
B1、C1孔里加100μl没稀释的阳性对照液
其他每孔里加入100μl的没稀释的牛奶样（每孔里只加一个样）
盖上盖子，在21℃（±5℃）温浴过夜。
2.洗涤
每瓶浓缩洗涤液需要用1900毫升的蒸馏水稀释（稀释20倍），稀释后的溶液称为“洗涤液”。1瓶原液（100毫升）能全部用完的情况下，有结晶[5℃（±3℃）]也可以稀释（只需稀释部分溶液则必须等结晶全部溶解）。
用“敲打法”或其他更好的手工或自动方法把微量滴定孔中的液体排空。
每孔中加入洗涤液，再次排空。
重复两次“敲打法”（共洗3次）。
3.酶标连接物的稀释、分配
用稀释液1把酶标连接物按1:100的比例稀释。
每孔里加100μl的被稀释的酶标连接物。
盖上盖子（自带的盖子或铝箔片），在21±5℃温浴30±5分钟。
4.洗涤
用敲打法或其他方法排空微量滴定孔里的溶液。
所有的孔里加满洗涤液，再排空。
重复2次（共洗3次）。
5.显色
每孔里加入100μl的待用显色液5。
在21±5℃温浴20分钟（避光）。
每孔里加入100μl的终止液。
轻轻地摇动微量滴定板，使有色溶液混匀，并谨慎地轻擦微板底部。
6.读取数据
读取在450nm的光密度（OD450），光度计必须先校正。
以下方式计算每个血清样与阴性对照相比的抑制作用的百分比。
抑制作用（%）=（样品的OD450值/阴性对照平均OD450值）×100
7.有效性确认标准
在以下情况下，认为检测结果有效：阴性对照最小平均OD450值应是0.800，并且阳性对照竞争作用百分比小于20%。
8.结果的判读
（1）血清、血浆样检测结果的判读
一是个体血清、血浆的BVDV的诊断及个体血清或混合血清样BD的诊断
抑制作用百分比≥50%的样品，其个体被认为不带有BVDV（或BDV）特异性抗体；
抑制作用百分比在40%～50%之间的样品，其个体被认为是可疑的；
抑制作用百分比≤40%的样品，其个体被认为带有BVDV（或BDV）特异性抗体。
注释：对抑制作用百分比在可疑范围内的样本（检测个体血清、血浆或混合血清样BDV的情况下），建议用其他方法来证实其状况。
二是混合血样BVDV检测结果的判读
抑制作用百分比≥60%的样品，这一组个体被认为不带有BVDV（或BDV）特异性抗体。
抑制作用百分比在50%～60%之间的样品，这一组个体被认为是可疑的。
抑制作用百分比＜50%的样品，这一组个体被认为带有BVDV（或BDV）特异性抗体。
注释：对呈现阳性的混合样，通过对这一组个体进行个体血样分析来确定其结果。
（2）牛奶样检测结果的判读
一是对群体的定性检测：任何一个样，其抑制作用都≥80%，它们的群体被认为还没感染BVDV；任何一个样，其抑制作用都＜80%，它们的群体被认为已感染BVDV。
二是群体内传播程度的分析：罐装奶的检测结果，抑制作用≥80%，这群体的传播程度低于10%；抑制作用在45%～80%之间的样，其群体的传播程度在10%～35%之间；抑制作用＜45%的样，其群体的传播程度高于35%。
9.总结
1-个体血清、血浆的BVDV的诊断及个体血清或混合血清样BD的诊断
2-混合血样BVDV检测结果的判读
3-牛奶样检测结果的判读
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