追寻记忆的痕迹

正如坎德尔所说，布伦达·米尔纳通过对H. M. 的研究，开辟了记忆研究的道路。但是有关记忆存储机制的问题，依然悬而未决。尽管卡哈尔在1894年就猜想过记忆存储在神经元之间新长出的联结之中，但是因受当时技术条件的限制，他无法证明这种突触变化，也没法进一步研究这种记忆突触假说。直到20世纪60年代，有关记忆存储机制才为坎德尔所证实。

坎德尔1929年出生于奥地利首都维也纳的一个犹太人家庭。9岁生日后的第2天，父亲送给他一辆崭新的蓝色玩具汽车作为生日礼物，他甚是喜欢。正在一家人其乐融融之时，一阵急促的“咣咣咣”敲门声打断了这宁静欢乐的气氛，一群纳粹警察冲了进来，把他们从家里扫地出门。等大约一星期后终于得到允许回家一看时，家里已经一片狼藉，他心爱的玩具汽车和其他值钱的东西都早已不翼而飞。只要一提起这段痛苦的经历，当时的情景就栩栩如生地在他的脑际浮现，就好像只是昨天发生的事情。这也许是他对记忆产生好奇的开端吧！

10岁那年，为躲避纳粹的迫害，坎德尔随父母从奥地利迁居美国，成为了一名犹太移民。在哈佛大学时，坎德尔主修欧洲史和欧洲文学专业。当时他有一位也是从奥地利移民到美国的好朋友，其父母和弗洛伊德过往甚密，他们对坎德尔影响颇深，令他对精神分析产生了强烈的兴趣。所以大学毕业后坎德尔来到纽约大学医学院转读医学。通过对神经生理的系统学习，他不再停留在一名业余爱好者对“自我”这类脑的最玄妙问题的空想，而开始考虑可以用实验进行研究的课题。就在这段时间里他读到了库夫勒有关龙虾和螯虾感觉神经元细胞体和树突中的兴奋和抑制的三篇论文。库夫勒在文中写的一段话给了他极深的印象：

我们所用的标本的最大优点就是容易操作，因为所有的细胞成分都能加以孤立，而且看得到。此外，根据这些标本的牵张感受器特性，我们可以控制和测量这些结构的兴奋度。特别有意思的是，甲壳纲动物的感觉细胞的许多解剖学性质和脊椎动物的中枢神经系统中的细胞惊人地相似。

这段话使他领会到应该怎样进行科学研究，也让他意识到选择适合于所研究问题的标本是何等的重要，必须认真看待无脊椎动物对科学研究的重要性。

当时，布伦达·米尔纳关于失忆症病人的工作使他十分兴奋，他想也许研究记忆的生理基础会有助于理解更高级的心理功能。

一开始，他想知道对记忆有重要作用的海马神经细胞和当时已经研究得比较透彻的脊髓运动神经元究竟有什么不同。他也确实成功地记录到了猫海马神经细胞的电活动，并发现两者在活动方式上稍有不同。但是他很快意识到，尽管这个研究很有意思，却正在引导他偏离研究记忆的初衷。因为直到此时，他才意识到海马神经元和脊髓运动神经元性质上的这些不同对解释前者在记忆中的作用并没有什么帮助。他意识到对记忆起重要作用的是神经元和神经元之间的联系，而不是神经细胞本身的特性。

那么如何来研究在学习和记忆过程中神经元相互之间的突触联系的变化呢？坎德尔明白要在脊椎动物的海马甚至是脊椎中进行研究十分困难。这时他想到了库夫勒、霍奇金、哈特兰等先驱者的经验：在一开始的时候研究尽可能简单的基本形式，并且要找有尽可能简单的神经系统的动物作为标本来进行研究。这样坎德尔就给自己定下了下列目标：要找一种低等动物，它只有数量比较少的神经元（但是这些神经元本身需要比较大，而且要易于在标本中辨认出来），并构成结构固定的神经回路，这个回路要比较容易定位，并且这种回路所控制的简单反射可以随着学习而变化。条件确实相当苛刻，幸而他工作的美国国家卫生研究院是国际上脑研究的一个中心，不断有一流的脑科学家到院里来作报告，他们使用了各种各样的实验动物，让他可以比较衡量。其中有两位法国科学家介绍了一种名为海兔的动物。他们报告说：海兔的神经系统一共只有2万个左右的神经元（想一想人脑中有上千亿个神经元），它们大体上组织成了9个神经节。这些神经元还很大（它们比哺乳动物中比较大的神经元还要大上约50倍），几乎用肉眼就可以看到。另外，其中一些细胞还很容易辨认，这样就大大地方便了研究者确定神经回路的“线路图”。这正是坎德尔所要寻找的理想动物！不过当他去向一些权威征求意见时，却被兜头泼了一盆冷水，他们怀疑用这样低等的动物来研究像人的记忆这样复杂的过程会有什么用。但是坎德尔依旧坚信像海兔这样简单的动物也会有“所有动物都共有的基本学习形式”。

现在的问题是怎样用海兔来研究记忆和学习的机制。坎德尔是一位勤奋的科研人员，整天泡在实验室里，这终于使他的妻子怒火万丈。在一个星期天的下午，她抱着儿子冲到了他的实验室里，冲着他尖声叫道：“你不能再这样下去了。你只想到你自己和你的工作，你一点也不关心我们俩！”坎德尔感到非常意外和委屈。过了好几天他的心情才平静下来，并且想清楚了工作和家庭的关系，他确实应该多花一点时间在家里。让坎德尔没有想到的是，不在实验室里整天忙于实验却使他有时间来考虑怎样用海兔来研究记忆和学习机制的问题。他后来回忆说：

德国作曲家施特劳斯（Richard Strauss）认为他经常是在和妻子争吵以后写出最好的曲子。对我说来并非如此，但是丹尼丝（Denise）⁽⁷⁾要我多花一点时间陪她和保罗（Paul）⁽⁸⁾，实际上真的是让我停下来进行思考。……实际上，思考比只是更多地做实验更有价值。⁽⁹⁾

就在坎德尔在家里陪伴家人的时候，他想起了巴甫洛夫（Иван Петрович Павлов）的包括条件反射在内的三种学习形式（习惯化、敏感化和经典条件反射），以及卡哈尔有关突触变化可能对学习有重要作用的思想。也是在这段时间，坎德尔读到了美国密歇根大学的多迪（Robert Doty）的一篇报告。这篇报告记述了，多迪用弱电刺激狗的视觉皮层并不引起狗的运动，而刺激狗的运动皮层则引起狗爪运动，然后他同时多次施加这两种刺激，结果发现，以后即使单单只在视觉皮层上施加弱电刺激也会引起狗爪的运动。这个工作说明建立经典条件反射并不需要像动机之类的复杂的精神活动，而只要有两个配对的刺激就可以了。其实，在更早的时候，坎德尔就读过斯金纳（B. F. Skinner）的名著《生物体的行为》（The Behavior of Organism）一书，这本书里详细介绍了习惯化、敏感化、经典条件反射和操作条件反射等最简单的学习形式，不过这些工作都是针对动物整体的，用来观察其行为变化的，并没有牵涉其内部机制问题。坎德尔突然想到他也可以把同样的方法应用到孤立的海兔神经节上。当他记录神经节中的单个细胞时，他可以用弱电流刺激到神经节去的一条轴突通路作为条件刺激，而把刺激另一条通路作为无条件刺激，这样他就可以看到对这些刺激模式起反应时突触是否会发生系统性的变化，如果有变化的话，那么这种突触变化是不是和整个动物的整体行为一致。这样就有可能开辟一条研究这些最基本的学习记忆形式的神经机制的途经。不过当时各方面的条件还没有成熟，他把这些思想暂存脑中。

图3-5　海兔的腹神经节。

1965年坎德尔应邀到纽约大学医学院从事行为神经生物学工作。这样他就可以全力以赴地把他脑中积累起来的思想付之实践了。坎德尔从海兔的神经系统中分离出一个只有2000个神经细胞的腹神经节，把它放在一个不断通气的海水槽中。然后他把一根微电极插到了一个他命名为R2的神经元中，记录它对各种刺激的反应。实验模仿了巴甫洛夫对狗所做的习惯化、敏感化和经典条件反射这三种不同形式的学习方式。不过他比巴甫洛夫进一步的地方是，他并不只限于观察行为，而且还深究引起这些行为的神经回路。他的第一个大的发现是，虽然海兔学习有快有慢，但是它们用到的都是同一条只有30个神经元的回路，这里并没有发现以前盛行的回响假说中的环路，并且这些回路是生而有之，只是其中神经元之间的联结强度可以随经验而变化，这说明这种记忆只能是通过突触的变化引起的。关于这一结论的实验证据我们将放在下面再来详细介绍。

对一种无害的刺激，如果多次施加，那么动物的反应会越来越小，这种现象就称为习惯化。也就是说，动物学会不理会经常发生的无害刺激。坎德尔在一束通向R2细胞的神经纤维上施加弱电流刺激，并重复10次。结果发现随着刺激次数的增多，细胞上的突触电位越来越小，最后减弱到第一次时的二十分之一。

和习惯化相反，在给动物施加强刺激以后，再施加一个原来只引起很小反应的刺激也会引起大得多的反应。“一朝被蛇咬，十年怕井绳”说的正是这个意思。这就是所谓的“敏感化”。坎德尔在海兔上也建立起一个敏感化的模型。他先在通向R2细胞的一条神经通道上施加一两个弱的电刺激，把由此产生的突触电位作为基准。然后他向通向R2细胞的另一条神经通道上施加一个强刺激，在这以后再用同样的弱电流刺激第一条通道，结果发现此时产生的突触电位有了大幅度的提高。这说明这条通路的突触联系大大加强了。

关于巴甫洛夫经典条件反射，狗听到饲养员的脚步声就会分泌唾液的例子，这是大家耳熟能详的，这里不再赘述。与此相应，坎德尔在一条神经通道上先施加一个弱刺激，然后在另一个通道上施加一个强刺激。如此结合多次，以后只要加上那个弱刺激，即使其后不施加强刺激，依然会引起强烈的反应。

坎德尔对上面的实验结果总结说：

通过一个模仿行为学条件范式的实验流程，改变了神经细胞之间的联系强度，这种改变可以持续半小时以上。这说明和突触强度有关的一系列变化可能是动物中某些简单信息储存形式的基础。

在坎德尔之前，绝大多数神经科学家认为动物的行为和细胞机制跨距太大，因此很少从细胞水平去研究行为机制。坎德尔第一个打破了这一禁忌，在20世纪60年代中，他率先在纽约大学建立了一个实验室，专门研究行为的产生和学习调控行为的细胞机制。

为了在在体条件下取得学习能改变突触联系效能的直接证据，坎德尔把他的研究集中到海兔的一个简单反射——缩腮反射。腮是海兔的呼吸器官，位于由外套膜围成的外套腔内。外套腔终止于虹吸管。如果轻轻地触摸一下虹吸管，就会引起一个快速的防御反射，虹吸管和腮都迅速地缩到外套膜里面，以防止受到伤害。对这样一个简单的反射，也可以建立起习惯化和条件反射。反复触摸虹吸管，会使缩腮反射越来越弱。如果在触摸虹吸管之后，在海兔的尾部施加一个强烈的电刺激，就会引起强烈的缩腮反射。如此结合数次以后，即使不再施加强刺激，只要触摸虹吸管也会引起强烈的缩腮反射，这一效果可以维持一段时间，也就是说，形成了记忆。下一步的工作就是要确定负责缩腮反射的神经回路。幸运的是，海兔神经节中的有些神经细胞很容易辨认，它们有自己固定的位置、颜色和大小。为了要确定神经细胞和神经细胞之间的联系，坎德尔在一个细胞里面插上微电极，然后对其他细胞施加刺激，每次只刺激一个，观察它们对插有微电极的细胞的影响，这样就可以确定哪些细胞之间有联系，这种联系是兴奋性的还是抑制性的。通过艰苦、细致的长期工作，他们终于画出了缩腮反射的“线路图”。

图3-6　缩腮反射的“线路图”。（引自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21648/）

根据这个线路图，坎德尔实验室发现，触摸海兔的虹吸管会激活感觉神经元，感觉神经元的动作电位又在运动神经元中诱发出一个突触电位，导致后者发放神经脉冲，最终引起缩腮反射。记录这个突触电位，他们发现在习惯化和敏感化的过程中，这个电位大小的变化和动物的行为变化是完全一致的。因此，他们的工作表明：学习和记忆的神经基础不仅有先天决定的神经回路，而且还和后天由经验所引起的神经细胞突触联系效能的变化有关。

在这以后，他们进一步发现短时记忆是突触联系强度变化的结果，而长时记忆则还需要结构的变化，有的突触会消失，但也会产生新的突触，前者对应于遗忘，而后者则对应于巩固短时记忆（固化）；此外把短时记忆固化为长时记忆甚至还需要合成新的蛋白质和改变基因表达，这是形成新的突触所必需的。有一种蛋白质——“环腺苷酸（cAMP）应答元件结合蛋白质”（cAMP response element binding protein，简称CREB蛋白质）可能在把短时记忆突触变化转化为长时记忆突触变化中起到关键作用。一个关键证据是当他们阻断了感觉细胞核内CREB蛋白质的作用后，突触联系的长时强化被阻断，而短时强化则不受影响。他们还发现了存在两种CREB蛋白质亚型，其中一种易化基因表达，而另一种则抑制基因表达，前者促使短时记忆向长时记忆转化，而后者则阻断这种转化。因此，只有当给予一次很强的刺激或者反复给予刺激，使后者的作用受到遏制，而前者的作用超过了某个阈值时，这种事件才能进入长时记忆。至今人们对“9·11”事件仍记忆犹新，而为了记住一个外语单词则需要反复背诵或是反复查词典才行，正是这样的例子。就这样，坎德尔决定把对学习和记忆的研究进一步深入到分子和基因的水平，为此他不得不学习他原来并不熟悉的分子生物学技术。如果要讲清楚这些问题，就需要从头介绍分子生物学的基本知识，限于篇幅和本书的主题，我们将不再讲下去。想对这个问题有深入了解的读者，以及对坎德尔的工作有强烈兴趣的读者，笔者建议读一下坎德尔的自传性作品——《追寻记忆的痕迹》（In Search of Memory）⁽¹⁰⁾。

对于坎德尔的贡献，美国著名激素研究领军科学家巴查斯（Jack Barchas）是这样评价的：“坎德尔是真正的天才表现在他一直勇于改变、不断前进并不懈地追问新问题。科学上我们总是在爬一条滑溜溜的绳索。每过一会总有人在上面打个结，从而使别人能站在上面继续往上爬，坎德尔在绳上打了许多这样的结。”

顺便说一句，最近在寻找记忆痕迹，即某种特定记忆在脑内的物质基质方面，又有了新的突破性进展。席尔瓦（Alcino Silva）是坎德尔的好朋友、另一位诺贝尔奖得主利根川进（Susumu Tonegawa）的博士后。席尔瓦认识到激活CREB蛋白质在长时记忆的形成和保持中扮演着重要的作用。1994年，席尔瓦对他培育出的无CREB蛋白质功能的小鼠做了一个水迷宫实验，第一天席尔瓦教这只小鼠在水池中找到隐藏在混浊水面下的平台，到了第二天再把它放到这种“水迷宫”中，它就完全不记得昨天刚学到的一切了，就像是初生的幼鼠。席尔瓦的这一发现吸引了许多科学家，其中包括他后来的合作者乔斯林（Sheena Josselyn）。乔斯林向大鼠脑中的外侧杏仁体（恐惧中枢）添加额外的CREB蛋白质。她对这些大鼠和另一组正常大鼠的对照组做巴甫洛夫的经典条件反射实验，实验中用的无条件刺激是中等强度的电击，而条件刺激则是给光。一旦完成训练之后，有额外CREB蛋白质的大鼠一见到光跳起的高度是对照组的5倍。由此她意识到CREB蛋白质不仅对形成正常的长时记忆是必需的，而且还是某种“记忆增强剂”。

2001年，席尔瓦邀请乔斯林和她的丈夫（也是一位神经科学的博士后）到他那儿工作。他们把细胞内有能发荧光的CREB蛋白质的小鼠放到一个笼子中，在给它们听某个纯音时给予电击，以后即使不给电击，小鼠只要一听到这个纯音就会由于恐惧而木僵不动。

2003年，乔斯林夫妇去多伦多工作，他们推测如果富含CREB蛋白质的神经元确实对维持记忆很重要的话，那么杀死这些细胞就应该会使相应的记忆被消除。事情果然如此，他们再次训练小鼠听觉恐惧条件反射，那些有富含CREB蛋白质的神经元的动物对声音表现出更大的恐惧感，而在选择性地杀死这些细胞之后，这些动物对声音就一无所惧了。就这样，他们似乎终于找到了恐惧的记忆痕迹。当然一只小鼠对单个引起恐惧的事件的记忆是一回事，而在人记忆中复杂的联想，可能要牵涉许许多多神经联结的网络，这又是另一回事。所以，不能说他们的工作彻底解决了记忆痕迹究竟在哪里的问题。乔斯林自己也说道：“我们研究的是记忆的一种非常简单的基本类型。对一只老鼠，您不可能问它：‘你还记得昨天把你放进去的那个笼子吗？’我们所能做的仅仅是观察它们的行为，以确定它们有没有学到了些什么。像您在回想您经历过的某个事件这样的复杂的回忆储存在许许多多不同的脑区中。”

1964年，挪威科学家洛莫（Terje Lømo）刚刚离开挪威海军要找工作，有一天他在奥斯陆的大街上偶遇挪威神经科学家安德松（Per Andersen），后者刚从澳大利亚埃克尔斯实验室回到挪威筹建自己的实验室，因此正需要人，于是洛莫就到了安德松的实验室工作，并在一年多以后开始攻读博士学位。洛莫在和安德松讨论之后，确定了自己的论文方向将集中在安德松研究过的“频率增强”（frequency potentiation）现象上。安德松从海马齿状回的前穿质通路（perforant path）给予颗粒细胞强直刺激（tetanic stimulation，即一连串很密集的电震），他发现在刺激停止之后，颗粒细胞的兴奋性还会持续增大数秒甚至半分钟。1969年，洛莫对博士论文《海马结构齿状回的突触机制和组织》（Synaptic Mechanisms and Organization in the Dentate Area of the Hippocampalformation）进行了答辩。

图3-7　海马内部的解剖结构。DG为齿状回，其通过前穿质通路接受来自内嗅皮层的输入，而齿状回神经元的轴突与CA3神经元形成突触。CA3神经元的轴突分成两分支，一支经穹窿离开海马；另一支经谢弗侧支，与CA1神经元形成突触。

在洛莫的论文中，他记录了当在前穿质通路加一连串刺激时齿状回中细胞体层和树突层的场电位。他特别注意这种刺激的后效应，以前人们报道过这种后效应类似于强直后增强（posttetanic potentiation，简称PTP），一般只持续几分种。之前虽然也观察到过在脊髓中有长达数小时的PTP，但是只有在长期给予高频刺激之后才能观察到。人们一般认为这种后效应只是突触可塑性的一种表现，但并不是学习的可能机制。例如，埃克尔斯就曾这样说过：“要想用所显示的突触效能的这种变化⁽¹¹⁾来解释学习和建立条件反射的最不能令人满意的一个特点就是，为了产生能检测得出的突触变化需要长时间的过度刺激。”

1966年洛莫用麻醉兔作为实验材料，他通过前穿质通路给海马齿状回颗粒细胞一短串刺激，结果发现此处的突触效能提高并能维持几个小时。在做实验的时候，一如他所能预见的那样，当给前穿质通路单个脉冲电刺激时，在齿状回细胞中诱发出兴奋性突触后电位（excitatory postsynaptic potential，简称EPSP）。但是出乎他的意料之外的是：如果他先在突触前纤维上加上高频刺激串，在接下来的时间里即使只加单脉冲刺激也能引起更强的EPSP，而且这种效应能持续很长时间。这种现象就被称为长时程增强（longterm potentiation，简称LTP）。洛莫的这一工作也就成了LTP研究的发轫之作。由于海马结构简单，同时，离体的海马切片可以在合适的灌流条件下存活数小时，使实验者便于精确给刺激和记录，因此以后许多对LTP的实验都是在海马切片上进行的。

自从洛莫发现LTP以后，人们普遍认为LTP是海马中学习记忆的重要机制，并发表了上千篇论文。人们假定在海马中产生LTP是学习的结果，但是在此后的30多年中一直没有找到决定性的证据。1986年，莫里斯（Richard Morris）从动物的在体实验中首先提示LTP可能是形成记忆所必需的。他通过用药物改变大鼠海马的方法来测试它们的空间记忆。他把大鼠放到一个池水极度混浊的水池中，池壁垂直而无法攀缘，只有在水面下某处才有一个看不见的平台可供它歇脚。对正常大鼠来说，它们能把看不见的平台位置和周围环境中的显著标志联系起来。因此在经过训练之后，正常大鼠再被丢进水池时，它们能立即游向平台。然而用NMDA的阻断剂APV处理过海马的大鼠再被丢进去时，它们就会在池中乱游一气，好像以前从来也没有在池中训练过一样。这就是莫里斯水迷宫实验。他们然后把这两组大鼠的海马切片，结果发现对照组很容易诱发LTP，而用APV处理过的鼠则很难诱发LTP，这表明NMDA受体至少对某些类型的学习记忆是必需的，也间接提示LTP可能也是这些类型的学习记忆所必需的。然而应该指出的是，这个实验只是说明了LTP和这些类型的学习记忆之间存在相关性，还不能证明这两者之间存在因果关系。尽管以往此类实验都是对动物的习惯化、敏感化和条件反射，特别是恐惧条件反射做的，这些记忆都属于非陈述性记忆，其结论对于陈述性记忆是否也适用并没有证据，但此实验间接提示了这种可能性，因此还是很有意义的。

2006年，美国神经科学家贝尔（Mark F. Bear）等人让大鼠在一个两室的盒子里通过在暗处受到电击的方法学会避免待在暗处而只待在亮处，由此发现学习确实在海马的突触之间诱发LTP。贝尔说道：“我们证明了所有人都相信的一个信念：当学习时在海马中确实诱发出了LTP。这对神经科学家来说是一个很大的成绩，因为自我们知道LTP之后的30多年来一直未能得到这样的证据。”由于他们的研究比较专业，这并非一本科学普及图书所能详述的，有兴趣的读者可以参看相关文献。⁽¹²⁾