基因克隆产物是怎么测序的

第二节　目的基因的获取

基因工程的目的就是外源基因的克隆与表达，因此，以一定的手段获得所要克隆的目的基因是极其重要的一部分。目的基因又称外源基因，即我们所要研究的感兴趣的基因。根据研究对象和研究目的的不同，目的基因可来自原核细胞或真核细胞，或者为经过人工改造的或人为设计的DNA序列。原核生物基因组较简单，较易获得目的基因。哺乳动物真核细胞基因组庞大复杂，可根据不同的要求选择适宜方法，从中获得目的基因，方法较多，主要可通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）、反转录－PCR（reverse transcription－PCR，RT－PCR）、人工合成、基因文库筛选等方法获得。

一、PCR方法获取目的基因

应用PCR法可以直接从染色体DNA或其他DNA模板序列快速简便地获得目的基因片段，在基因克隆中，如果已知目的基因片段两侧或附近的DNA序列，就可以通过设计一段引物并应用PCR方法直接从DNA序列中在体外扩增目的基因片段。

1.PCR扩增　PCR技术是一种选择性体外扩增DNA片段的方法，基本原理类似于DNA在细胞内的复制过程。在体外反应的试管内，加入少量模板DNA、寡核苷酸引物（模板片段两端的已知序列）、耐热DNA聚合酶、合适的缓冲系统及4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）。在适当的反应条件下，DNA聚合酶可以以寡聚核苷酸为引物，以单链DNA为模板，催化合成新的DNA链。整个扩增过程分为三步。①变性：加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链；②退火：突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合；③延伸：在DNA聚合酶及Mg^2＋等存在的条件下，从引物的3′端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链。上述三步为一个循环，从理论上讲每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加1倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增10⁸～10⁹倍（图3－5）。

在基因工程研究中，PCR技术由于能以极其简便而快速的链式反应获取目的基因，而且可以通过在引物中引入酶切位点方便后续的克隆操作，克服了构建目的基因克隆中的一系列的DNA酶切、连接、转化子检测等复杂繁琐的操作过程，快速地进行外源基因的克隆操作，因而被广泛采用。然而，待克隆的PCR产物通常是一系列不同大小的DNA片段的混合物，末端各不相同，使用传统的克隆方法效率往往很低。而且PCR产物并不是平末端，可能需要进行纯化和修饰。

图3－5　PCR扩增

2.PCR产物的纯化　PCR产物是否需要纯化以及如何纯化取决于所要采用的克隆策略。比如说，如果克隆之前先要用限制性内切酶（不论是PCR产物内部还是引物上有位点）酶解产生5′突出或平末端的话，那么完全除去Taq DNA聚合酶和dNTPs就非常重要了，否则5′突出端就会被填平甚至会加上一个3′突出碱基。另外，PCR常常会得到一系列大小不同的产物，因此有必要从中分离出所需目的基因片段。可用琼脂糖凝胶把PCR产物分开，然后把所需的片段回收出来。

3.PCR产物的修饰　1988年Clarke发现所有的PCR产物都在Taq DNA聚合酶的作用下在3′端附加上了一个突出的腺苷酸，这就解释了为什么使用平端载体克隆PCR产物时会很困难。为了避免这个问题，一种办法是在寡核苷酸引物中设计限制性内切酶位点，所得的PCR产物经过酶切产生合适的末端，方便与载体进行连接；或者也可以利用PCR产物的3′突出脱氧腺苷酸将其克隆进含有3′突出的脱氧胸腺嘧啶的载体中。

PCR技术的出现大大方便了基因的克隆。利用该技术也可将平末端DNA改造成黏末端。在设计针对目的基因的5′和3′端引物时，分别在引物中导入限制性酶切位点（相同或不同），以目的基因为模板，经PCR扩增获得带有引物序列的目的基因，用相应的限制性酶切割后，可将其连接到经相应限制性酶切割的载体中。若在两引物中导入不同的限制性酶切位点，则可达到目的基因与载体之间的定向连接和避免载体DNA的自身环化。

二、RT－PCR法

利用PCR法可直接从细胞基因组DNA中获得目的基因，但是此法获得的来自真核生物的目的基因可能带有内含子，不能直接用于原核表达。如果用人工的方法将内含子去除，是一种极其繁琐费力的事。为了获得不含内含子的完整的连续编码序列，可采用RT－PCR。利用反转录病毒依赖于RNA的DNA聚合酶，在反义引物或oligo（dT）的引导下合成与mRNA互补的DNA，再按普通PCR的方法以cDNA为模板，扩增出不含内含子的可编码完整蛋白的基因。因此RT－PCR是获取目的基因的一条重要途径。

三、基因文库筛选

基因文库（gene library）是指一种载体中理想地包含着某种生物体全部遗传信息的随机DNA片段的总和。哺乳动物细胞内基因组庞大，要想从中获取某一基因犹如大海捞针，绝非易事。利用DNA重组技术把某种生物细胞的所有基因分区组装到载体（质粒或噬菌体）上，并随载体导入宿主细胞中进行克隆培养和保存。这种克隆群体就像图书馆的书库一样，里面保存着该生物全部遗传信息的文本，称为DNA文库。若需要哪一种基因，可随时从中抽取。比如用与目的基因互补的带标记的核酸探针可将目的基因从众多的基因中筛选并分离出来。

按容纳的DNA性质分，可将基因文库分为基因组文库（genomic library）和cDNA文库（complementary DNA library）。基因组文库是含有某种生物体全部基因组的随机片段的重组DNA克隆群体，其构建的基本过程是：先提取原核或真核细胞的基因组DNA，通过一定的方法如机械剪切或限制性内切酶随机降解法使之成为一定大小的片段，将其与适当的载体（质粒或噬菌体）进行体外重组，并将连接产物转化细菌或包装成噬菌体，从而得到一组含有该生物体不同DNA片段的克隆。尽管所得的每一个克隆仅含有基因组的某些片段，但只要切割基因组是随机的，而且所得到的克隆数足够大，所构建的克隆群体就可能包括了基因组内的各种基因片段。cDNA文库是指含有某种生物体全部cDNA的随机片段的重组DNA克隆群体。其构建的基本过程是：先提取真核细胞的mRNA，反转录合成cDNA第一链，然后在DNA聚合酶等作用下合成cDNA第二链，从而得到不同长度的双链cDNA，将其与适当的载体相连接，连接产物导入宿主细胞，得到一组含有该生物体不同cDNA片段的克隆。不论是基因组文库，还是cDNA文库，它们都使DNA片段的筛选和获得成为可能。

如果手头有含有目的基因的基因文库或cDNA文库，就能以目的基因片段为探针，用菌落或噬菌斑原位杂交筛选阳性克隆，再从阳性克隆中用限制性酶切获得目的基因。另外，也可通过PCR从上述筛选到的阳性克隆中获得目的基因，或者直接提取基因文库DNA，用PCR法扩增和分离目的基因。

四、化学合成

目前可利用DNA固相合成仪合成单链DNA片段，一次合成的长度一般＜100个核苷酸。通过互补单链DNA片段之间的退火，可获得双链DNA片段。对于分子较大的目的基因，可通过分段合成，然后将这些双链DNA片段连接组装成完整的目的基因。

由于核酸的化学合成技术不断完善，DNA的人工合成发挥着越来越重要的作用。化学合成基因具有快速、有效，不需收集基因组织来源的优点，特别在获取小片段目的基因，设置某种生物偏爱密码子在该种生物中的高效表达、采用以及消除基因内部的特定酶切位点，获取天然基因的衍生物等方面都具有其他方法无可比拟的优点。