甲基化检测方法

第二节　DNA甲基化检测方法

DNA甲基化是表观遗传学（epigenetics）的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。一般根据研究目的的不同可分为：基因组整体水平的甲基化检测，特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。Christina Dahl和Per Guldberg归纳总结了主要的甲基化分析方法及相关特性，在此基础上我们对目前常用的甲基化检测方法作一介绍（表10－3）。

表10－3　常用甲基化检测方法

一、变性高效液相色谱法（DHPLC）

DHPLC是一种新型高通量的分子生物学工具，以前主要用于双链DNA片段长度分析、寡核苷酸长度分析和基因点突变快速筛选。商品化的DNASep色谱柱，能用于不同长度（100～1500bp）DNA片段的分离和定量测定。先用软件根据核苷酸序列计算出待测DNA双链分子热变性（解链）温度，自动生成在该温度下分离单链和双链DNA分子的流动相梯度洗脱程序。存在点突变的靶序列与野生型序列经过变性和复性处理，能杂交形成不完全互补的杂合双链DNA，其变性温度略低于能够完全互补的纯合双链DNA，DHPLC能够将这4种不同的双链DNA分离开。

邓大君等将其改进与PCR联用建立了一种检测甲基化程度的DHPLC分析方法。由于亚硫酸氢钠基本不会修饰m⁵C，与未甲基化的CpG岛模板相比，甲基化CpG岛模板中保留了数目众多的未修饰m⁵C，变性温度明显高于前者（2～3℃），在DHPLC中保留时间显著延长，所以在DHPLC中两者能被轻易区分。

DHPLC特别适合分析细胞构成混杂，同时存在甲基化和非甲基化模板的组织样品，并还可获得基因一级结构变异的信息。DHPLC测定法虽然能够测定整个扩增区域内CpG位点的甲基化，但是不能对甲基化CpG位点进行精确定位。

二、SssⅠ甲基转移酶法

SssⅠ甲基转移酶法基本原理为：³H－S－腺苷甲硫氨酸（³H－SAM）是甲基供体，反应底物是纯化后待测的基因组DNA，反应催化酶是来自于细菌的SssⅠ甲基转移酶。上述几种成分在反应缓冲液中混合，孵育30～60分钟后，在SssⅠ甲基转移酶催化作用下使基因组DNA的CpG位点发生甲基化。通过测定剩余的放射性标记SAM，即可得到原基因组整体甲基化水平，测到的放射性强度与所测DNA甲基化水平成反比。

由于SAM和SssⅠ甲基转移酶性质不稳定，易造成重复操作的同一实验结果误差大，必须设立自身对照来标化实验数据。DNA溶解是否均一也影响了DNA浓度的测定，解决的较好方法是在测定DNA浓度之前，先用识别位点不含CpG序列的限制性内切酶消化待测DNA，再用酚/氯仿抽提。这是较经典的方法，但应注意操作过程中的放射性核素防护。

三、基因组直接测序法

直接测序是由Frommer等提出的研究DNA甲基化方法。过程是：重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变（图10－5），行PCR扩增所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较，判断CpG位点是否发生甲基化。此方法是一种可靠性及精确度很高的方法，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为烦琐及费用昂贵。

图10－5　重亚硫酸盐处理过程示意图

注：DNA经重亚硫酸盐处理后，甲基化的胞嘧啶不变，未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶

四、甲基化特异性PCR

甲基化特异性PCR（methylation－specific PCR，MS－PCR）是检测基因组DNA甲基化水平的一种常用方法，原理是DNA经亚硫酸氢钠处理后，非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。在PCR反应时，有两套不同的引物对：其中一对引物序列来自经处理后的甲基化DNA链，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点发生了甲基化；另一引物来自经处理后的非甲基化DNA链，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点没有甲基化。两对引物都具有很高的特异性，与未经处理的DNA序列无互补配对。MS－PCR是一种快速检测方法，只需极少量的DNA用于分析，能用于微量的DNA或石蜡包埋组织DNA的甲基化分析。目前唯一能提供比MS－PCR更直接的甲基化分析技术是基因测序法。然而MS－PCR能在一定范围内对绝大多数CpG位点提供类似的信息，与测序法相比，它还具有简便快速、灵敏度高和无需使用昂贵的测序试剂及放射性核素等优点。

不足之处在于：①引物的选择和设计非常关键，否则易导致假阳性；②如果亚硫酸氢钠对DNA处理不完全，也易导致假阳性；③MS－PCR法是以引物中所有CpG位点胞嘧啶均完全甲基化为前提设计的，如果存在未甲基化的CpG位点则导致扩增困难；④这种方法对于区分不完全酶切和较少的甲基化等位基因较困难，同样检测小标本中的或甲基化等位基因群体中小部分的抑癌基因的高甲基化是不可靠的。

五、结合亚硫酸盐的限制性内切酶法（COBRA）

此法类似于MS－PCR策略，也可对任何DNA标本中特定位点的甲基化进行快速定量。检测时首先用亚硫酸盐处理待检测DNA，转化未甲基化的胞嘧啶为尿嘧啶，接着进行PCR扩增，引物设计在原序列中不含CpG位点但含有胞嘧啶残基的序列。然后纯化PCR产物、限制性内切酶酶切、聚丙烯胺凝胶电泳分离，最后杂交检测。所使用的限制性内切酶，要求它的识别序列中只有CG位点含C，如BstUⅠ（CGCG）或TapⅠ（TCGA）。若其识别序列中的胞嘧啶被甲基化，则酶仍然能切割DNA。根据电泳后带型的差异，来识别原标本中DNA甲基化状况（图10－6）。

图10－6　COBRA示意图

重亚硫酸盐处理DNA后行PCR扩增，用限制性内切酶（BstUⅠ）识别转化后序列中的酶切位点，消化产物电泳分离，与完全非甲基化阴性对照组比较，得出序列中特异位点甲基化水平

本法是一种快速、灵敏的甲基化定量检测方法，且不受DNA甲基化水平范围的限制，但其定量信息的准确性取决于亚硫酸盐处理DNA样本是否完全，且甲基化分析也受限于限制性内切酶的酶切位点。

六、MethyLight

即利用实时PCR（real－time PCR）测定特定位点甲基化情况的荧光法。其过程如下：先用重亚硫酸盐处理待测DNA片段。设计一个能与待测位点区互补的探针，探针的5′端连接报告荧光，3′端连接淬灭荧光，随后行实时定量PCR。如果探针能够与DNA杂交，则在PCR用引物延伸时，TaqDNA聚合酶5′～3′端的外切酶活性会将探针序列上5′端的报告荧光切下，淬灭荧光不能再对报告荧光进行抑制，这样报告荧光发光，测定每个循环报告荧光的强度即可得到该位点的甲基化情况及水平。若标记的探针未能与DNA杂交，则引物延伸不能跳过未甲基化位点，报告荧光不被切下和不发光。同样方法，也可对引物进行荧光标记，并通过不同标记的组合，检测多个位点的甲基化水平。

此法同时具有MS－PCR的特异性和灵敏性以及实时PCR的快速和抗污染特性，可对微量DNA的甲基化进行定量检测。此外，它还具备可重复性、所需样本量少、不需要电泳分离等特点。它可以为临床标本的分子生物学研究提供可靠的技术支持。缺点是费用高，测定每个位点都要用两端标有荧光素的探针和一对引物，且定量结果受以下因素的影响：①亚硫酸盐处理的效率，包括该过程中DNA的丢失和亚硫酸处理的彻底性；②引物和探针连接位点甲基化的密度；③甲基化和非甲基化靶序列的拷贝数量。

七、甲基化敏感性解链曲线分析

Worm等2001年报道的甲基化敏感性解链曲线分析（methylation－specific melting curve analysis，MS－MCA），是将DNA经重亚硫酸盐处理与Lightcycler联用检测DNA序列甲基化的方法，荧光素标记双链DNA。这种方法根据检测到的荧光度对应的解链温度，判断分析研究序列中甲基化的情况。在Lightcycler过程中，随着温度升高，逐渐达到DNA双链各解链区域的解链温度Tm，DNA呈区域性逐渐解链。一般说来，序列中CG含量越高，对应的解链温度越高。由于非甲基化的胞嘧啶经重亚硫酸盐处理后变为尿嘧啶、PCR后变为胸腺嘧啶，故其所在序列中的CG含量降低，热稳定性降低，解链温度降低。而甲基化的片段由于其CG含量高，故其解链温度高。所作结果与标准曲线对照，根据这种特性就可以明确研究序列中CpG的分布区及甲基化程度（图10－7）。

图10－7　p15lnk4b基因的荧光解链曲线

注：曲线a：重亚硫酸盐处理HL－60细胞（示p15lnk4b完全非甲基化）；

曲线b：重亚硫酸盐处理MOLT－4细胞（示p15lnk4b完全甲基化）；

曲线c和d：对应细胞取自慢性髓性白血病病人骨髓细胞（示p15lnk4b部分甲基化）；可见曲线a、b、c、d的解链峰值分别为81.3℃、88.9℃、84.4℃和86.2℃

八、MCA－RDA

即采用甲基化CpG岛扩增（MCA）联合代表性差异分析（RDA）的一种实验技术。以往的甲基化分析方法大多只能分析一种已知基因的甲基化情况，不能研究整个基因组的甲基化状况。MCA－RDA可以全面有效地分析整个基因组的甲基化情况，特别对未知甲基化基因片段的检测效果更好。因为此方法联合了两种技术，故分别介绍如下。

MCA基本步骤如图10－8所示。其中m代表甲基化的SmaⅠ酶切位点。B、D均为基因组中的CpG片段。SmaⅠ内切酶只针对未甲基化的SmaⅠ位点（－CCCGGG－）进行酶切，从而产生平末端；但对甲基化的SmaⅠ位点不起作用。XmaⅠ是SmaⅠ的同裂酶，它只识别甲基化的SmaⅠ位点（_－CCCGGG－），切割后形成粘末端（_－CCGG－）。此时，在T4 DNA连接酶的作用下连接相应的接头（RXMA或RMCA）。随后以接头片段为引物，PCR扩增带接头的DNA片段，从而富集基因组中甲基化的DNA片段。MCA产物可以直接与适当标记的探针在尼龙膜上进行点杂交，或者进行代表性差异分析（RDA）。

RDA基本操作流程如图10－9所示。将对照组样品设为驱赶子，待检测组样品设为检测子。驱赶子用SmaⅠ处理形成平末端；检测子用XmaI处理形成黏末端，从而可以与新接头相连。随后将检测子与驱赶子以一定比例混合（通常驱赶子的量要大于检测子）进行一轮PCR扩增。扩增后的结果一般有以下3种情况：①检测子－检测子：由于两端都有引物相连，所以这些序列以指数形式增加；②检测子－驱赶子：一端连有引物而另一端为平末端，这些序列只以线性方式递增；③驱赶子－驱赶子两端均无引物而不扩增。每轮扩增之后均用XmaⅠ切除接头形成粘末段并与新接头相连，同时进一步提高驱赶子的量（每个接头序列不同，故用到的延伸温度也不同）。一般杂交2～3轮之后，就可通过脂糖凝胶电泳分析得到的结果。

图10－8　MCA基本流程示意图

图10－9　RDA基本操作流程

RDA是将差减杂交与PCR有机结合形成的一种方法。现常用于研究基因组中细小的差异，如甲基化等。将驱赶子与检测子变性后进行杂交，两者的相同序列在复性后形成检测子－驱赶子杂合体，因其只有一端有引物而只以线性方式递增。而检测子中不与驱赶子杂交的片段在复性后形成检测子－检测子杂合体而得以指数级的扩增。因此扩增后能筛检出两组DNA标本中的差异片段。

MCA－RDA的优点在于：①可快速有效地用于全基因组甲基化的研究；②能够将差异表达的基因高度富集，重复性好，假阳性少；③对于各种未知基因的甲基化状态研究有较大优势。需要指出的是这种技术也存在一定的局限。如MCA所需DNA标本的质量要求很高，一般不适用石蜡包埋的标本；它只能检测出CpG岛中一定数量的CpG位点，而不是全部；它只对SmaⅠ的不完全消化产物敏感，且两个SmaⅠ位点的距离一般要在1000bp以内；MCA产物的GC含量很高，需要高GC含量PCR反应体系优化处理，才能得到满意的结果。