重组分子的构建

第四节　重组DNA分子的构建

重组DNA的基本过程是DNA克隆，即获得重组体DNA的无性繁殖系。它包括载体和目的DNA片段的制备、目的DNA片段与载体的连接、重组DNA导入受体细胞及重组体的筛选与鉴定等。

目的DNA的制备是DNA克隆的第一步。目前获取目的基因常用的方法有基因的化学合成法、酶促合成法、酶切法及PCR扩增法等。PCR方法可以从染色体DNA和cDNA模板中扩增得到目的基因，但该法只能用于已知序列的基因或与其同源性高的未知序列基因，且扩增的产物DNA序列发生差错的概率高达0.25%。尽管如此，PCR扩增方法因其快速简便的优点仍得到广泛的应用。化学合成目的基因的优点主要是可以任意制造并修饰基因，在基因两端方便地设立各种接头以及选择各种宿主生物偏爱的密码子。但对于大基因而言，该法的费用偏高。

构建或选择适合于克隆目的基因的载体是DNA克隆技术的关键。目的基因只有与适合的载体连接，并由其引入相应的受体细胞，才能在新的宿主细胞中得到扩增。在构建或选择克隆目的基因的载体时，要根据目的基因的特性，着重考虑以下几个条件:①有足够的容纳目的基因的幅度，并使目的基因能够借助于载体的复制与调控系统得到忠实的复制与增殖;②在非必要的DNA克隆区段有多种限制性酶的单一识别位点，易于目的基因片段与载体的连接、重组与筛选;③与宿主细胞有一个或多个利于检测的遗传表型(如抗药性、营养缺陷型或显色表型反应等);④拷贝数多，易与宿主细胞的DNA分开，便于分离提纯。

DNA片段的重组连接是在DNA连接酶的作用下，将目的基因与载体共价连接在一起。连接的方式不外乎两种，一种是黏端连接，另一种是平端连接。在这两种连接方式中又有多种技巧，比如黏端连接可以用同一种限制酶切割位点连接，也可以用不同限制酶切割位点连接，还可以用同裂酶切割后相连接。平端连接可直接用T₄DNA连接酶相连接，但更多的是加同聚尾，或人工接头后再进行连接。

外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后，要使其扩增和表达就必须把重组分子引入受体细胞。受体细胞可以是微生物细胞、动物细胞或植物细胞。目前应用最广的微生物受体是大肠杆菌K-12株的衍生菌，它是人工改造的安全宿主菌，在人的肠道几乎无存活率或存活率极低。除安全标准外，所采用的衍生菌株应该是限制酶缺陷型，即外源DNA进入受体菌不致被降解。此外，还应为重组缺陷型，这样可保证外源DNA在细菌内的完整、独立存在，而不与细菌基因组发生重组。

重组DNA分子导入受体细胞后能在选择培养基或抗性培养基上筛选。在选择培养基或抗性培养基上能生长的转化体还需要进一步筛选和鉴定。尤其是单酶切后进行的连接，存在大量自身连接环化的载体，即使以双酶切进行连接，也有可能因酶切不彻底而出现自身连接环化的载体。因此必须从转化菌中筛选出含有DNA重组体的菌落。常用的方法有α互补、营养缺陷型互补、插入缺失、酶切图谱分析、杂交、序列分析。