质粒的制备

实验一　质粒DNA的制备

一、实验目的

掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各种试剂的作用。

二、实验原理

碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，但染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

三、实验仪器、材料与主要试剂

1.仪器

恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅、1.5mL离心管、枪。

2.材料

含pUC18质粒的大肠杆菌，克隆有水稻外源片段的BAC大肠杆菌菌液。

3.试剂

溶液Ⅰ:50mmol/L葡萄糖、10mmol/LEDTA、25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、2mg/mL溶菌酶

溶液Ⅱ:200mmol/L NaOH、1%SDS

溶液Ⅲ:3mol/L NaAc(pH4.8)溶液、TE缓冲液:10mmol/L Tris-HCl，pH7.5、1mmol/L EDTA。

四、实验步骤

1.取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37℃过夜培养;

2.用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃摇床250r/min过夜培养;

3.吸取1.5mL菌液，12000×g离心2分钟，收集菌体，倒掉菌液;吸取1.5mL菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净;

4.加入300mL溶液Ⅰ振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀(注意:应彻底打匀沉淀或碎块)(剧烈);

5.加入300mL溶液Ⅱ，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟;

6.加入300mL溶液Ⅲ颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀(温和);

7.12000×g离心10分钟;

8.吸取800mL上清液(注意:不要吸取到飘浮的杂质)至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟;

9.12000×g常温离心15分钟;

10.倒尽上清液，加75%乙醇浸洗除盐(放置片刻或离心3分钟后倒去上清液);

11.室温放置或超净台上风干DNA;

12.加40mL灭菌超纯水或TE溶解;

13.质粒、BAC的质量检测，于－20℃保存。

五、实验结果

DNA质量检测:琼脂糖电泳检测。

六、思考题

1.溶液Ⅰ——溶菌液

(1)溶菌酶:它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1，4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH值小于8时，溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖:增加溶液的黏度，维持渗透压，防止DNA受机械切力作用降解。

(2)EDTA的作用:

①螯合Mg²⁺、Ca²⁺等金属离子，抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用(DNase作用时以一定的金属离子作辅基)。

②EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

2.溶液Ⅱ——NaOH-SDS液

(1)NaOH:核酸在pH值大于5，小于9的溶液中是稳定的。但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液Ⅱ中的NaOH浓度为0.2mol/L，加抽提液时，该系统的pH值高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。

(2)SDS:SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有:①溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。②解聚细胞中的核蛋白。③SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3…R+-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中(用RNase去除RNA时)受到干扰。

3.溶液Ⅲ——3mol/L NaAc(pH4.8)溶液

NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH值至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-Hac的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了反pH12.6的抽提液，调回pH值至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol/L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA，以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。

4.为什么用无水乙醇沉淀DNA?

用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比例和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺取DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇来替代无水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵)。但是加95%的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙醇，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA，一般在室温下放置15～30分钟即可。

5.在用无水乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L?

在pH值为8左右的DNA溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na²⁺中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须进行洗涤或重沉淀。

6.加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么还要用SDS与Kac来处理?

加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加Kac使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全，也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以Kac代替NaAc，也可以收到较好的效果。

7.为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液?

在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统(pKa=7.2)和硼酸系统(pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子将与Ca²⁺产生Ca(PO)₃₄₂沉淀;在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl(pKa=8.0)的缓冲系统，由于缓冲液是Tris-HCl/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大多采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。

8.如何选择聚乙二醇(6000)的浓度来沉淀DNA?

采用PEG(6000)沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同，PEG的浓度低，选择性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的浓度只需1%左右，小分子所需PEG浓度高达20%。本实验选择性沉淀4.3kb的pBR322质粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30%PEG，其最终PEG浓度为12%。PEG选择性沉淀DNA的分辨率大约为100bp。

9.抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好?

酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10%～15%的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走，也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合(1∶1)使用。

10.为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戌醇?

在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戌醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戌醇为24∶1之比。也可以采用酚、氯仿与异戌醇之比为25∶24∶1(不必先配制，可在临用前把一份酚加入一份24∶1的氯仿、异戌醇即成)，同时异戌醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

11.为什么要用pH 8的Tris水溶液饱和酚?呈粉红色的酚可否使用?如何保存酚不被空气氧化?

因为酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其在抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。用Tris调节至pH值为8是因为DNA在此条件下比较稳定，在中性或碱性条件下(pH5～7)，RNA比DNA更容易游离到水相，所以可获得RNA含量较少的DNA样品。

保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色的，这样的酚容易降解DNA，一般不可以使用。为了防止酚的氧化，可加入巯基乙醇和8-羟基喹啉至终浓度为0.1%。8-羟基喹啉是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气，防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或－20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。