实验二 质粒DNA的电泳检查
一、实验目的
掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学习琼脂糖凝胶电泳的操作。
二、实验原理
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH值的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。
三、实验仪器、材料与主要试剂
1.仪器
恒温培养箱、琼脂糖凝胶电泳系统、台式离心机、高压灭菌锅、紫外核酸检测仪
2.材料
DNA marker、pUC18质粒
3.试剂
(1)50×TAE(50倍体积的TAE贮存液)
配1000mL 50×TAE:
Tris 242g
冰醋酸 57mL
0.5mol/L EDTA 200mL
pH 8.0
(2)凝胶加样缓冲液 (6×)
溴酚蓝 0.25%
蔗糖 40%
(3)琼脂糖
(4)溴化乙锭溶液(EB) 0.5μg/mL
四、实验步骤
1.制备琼脂糖凝胶
按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表:
称取1.0g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100mL 1×TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液。
2.胶板的制备
(1)取干净的有机玻璃内槽，用透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严，不能留缝隙)。
(2)将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。
(3)将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。
(4)待胶凝固后，取出梳子，撕下透明胶带，放在电泳槽内。
(5)加入电泳缓冲液至电泳槽中。
3.加样
用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。
4.电泳
(1)接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极，DNA片段从负极向正极移动)。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。
(2)当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1～2cm处时，停止电泳。
5.染色
将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液(在200mL1×TAE缓冲液中加两滴溴化乙锭储存液即可)。注意:溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心不要污染环境。
五、实验结果
在紫外灯(360nm或254nm)下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出橘红色荧光条带(在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，紫外线对眼睛有伤害作用)。
六、思考题
1.影响带电颗粒在电场中泳动速度的影响因素有哪些?
2.凝胶电泳有哪些用途?用它怎样鉴定样品纯度?
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