实验二 动物组织总DNA的提取
一、实验目的
学习动物组织总DNA的抽提方法，掌握抽提动物组织总DNA的基本原理。
二、实验原理
由于动物细胞没有纤维素外壁，细胞外被含有大量蛋白质，用蛋白酶K进行消化可以裂解细胞。还可采用机械破碎动物的组织和细胞。
等离子型表面活性剂十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammonium bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA从核中和结合状态释放出来到抽提液中。苯酚和氯仿等能使蛋白质变性的有机溶剂加入后，使抽提液分相。水溶性很强的核酸(DNA、RNA)分布于水相，各种脂溶性物质和大部分蛋白质在有机相，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片沉淀和有机相中的各种其他成分。上清液中加入异丙醇或无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于双蒸水或TE溶液中，即得动物总DNA溶液。之后可加入RNA酶降解其中的RNA，再用氯仿除去RNA酶，得到较纯的DNA制剂。
三、实验仪器、材料和试剂
1.仪器:水浴锅，微量移液器，枪头(1mL、200μL、10μL)，枪头盒，离心管(1.5mL)，台式离心机，恒温箱，标签纸，磁力搅拌机，剪刀等。
2.材料:鱼的鳍条或肌肉。
3.试剂:抽提缓冲液:10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，75mmol/L NaCl，5mmol/L EDTA，0.5％SDS，TE缓冲液:10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0。
四、实验步骤
(一)DNA提取详细步骤和说明
1.抽提缓冲液在37℃水浴中预热，无水乙醇在－20℃预冷。
2.选取鱼5mm3的肌肉或5mm2的鳍条，放入1.5mL离心管中用干净的剪刀将其剪碎。
3.加入700μL抽提缓冲液及10μL1mg/mL蛋白酶K，摇匀，55℃消化4～6h或过夜。
4.冷却到室温的消化好的样品加入700μL的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，轻轻振荡10min，于4℃冷冻离心机中12000rpm离心10min。
5.用剪口的枪头轻轻吸取上层水相到一干净的离心管中，注意不要吸到蛋白层，再加入700μL的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，轻轻振荡10min，于4℃冷冻离心机中12000rpm离心10min。
6.用剪口的枪头轻轻吸取上层水相到一干净的离心管中，上清液中加入700μL的氯仿-异戊醇(24∶1)，轻轻振荡10min，于4℃冷冻离心机中12000rpm离心10min。
7.用剪口的枪头轻轻吸取上清液，然后在上清液中加入2倍体积的预冷的无水乙醇沉淀DNA。此步骤应上下翻转轻轻摇动离心管，直到有白色丝状沉淀出现，若无沉淀析出，放入－20℃1h，就会出现白色沉淀。
8.将DNA沉淀用枪头挑出，放入另一离心管中，加入800μL70％的乙醇，轻轻晃动30s，7500rpm离心5min。
9.倒掉上清液，将离心管倒立于铺开的纸巾上，数分钟后，直立离心管，干燥DNA(自然风干或用风筒吹干)。
10.加入20μL0.5×TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15h，使RNA降解。
11.置于－20℃保存、备用。
(二)DNA提取流程图
图2-1 动物基因组DNA提取流程
(三)DNA质量检测
琼脂糖凝胶电泳检测，实验原理和实验步骤见附录1。过夜酶切后的实验需要约4h。
五、结果分析
同植物基因组DNA一样，动物基因组DNA也是大分子。琼脂糖凝胶电泳图形与植物基因组DNA相似。酶切后图形类似(图2-2)。
图2-2 动物基因组DNA双酶切电泳图
六、注意事项
1.蛋白酶K要消化彻底。
2.用剪口的枪头轻轻吸取上层水相时，注意不要吸到蛋白层。
七、思考题
动物和植物总DNA的提取方法有哪些异同点?
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