实验三 大肠杆菌染色体DNA的提取
一、实验目的
学习高盐法制备细菌基因组DNA的方法，掌握高盐法制备细菌基因组DNA的实验原理。
二、实验原理
细菌是单细胞生物，在去污剂和蛋白酶K的作用下细胞膜裂解，释放内含物。高盐浓度和低温下裂解液中大量蛋白质被沉淀出来，与溶液中的DNA分离。随后用无水乙醇将溶液中的DNA沉淀出来，此方法优点是步骤简单、快速。
三、实验仪器、材料和试剂
1.仪器:培养箱，灭菌锅，超净工作台，离心管(1.5mL、7mL)，台式高速离心机，微量移液器，枪头(1mL、200μL、10μL)，枪头盒，漩涡振荡器，自来水泵，恒温摇床。
2.材料:大肠杆菌DH5α。
3.试剂:2×裂解buffer(20mmol/L Tris-Cl，200mmol/L NaCl，20mmol/L EDTA，1％SDS，pH8.0)，Proteinase K(10mg/mL)，6mol/L NaCl，RNaseA(10mg/mL)，无水乙醇，进口分装琼脂糖，1kb DNA ladder。
四、实验步骤
1.取1.5mL大肠杆菌DH5α过夜菌(37℃，180rpm摇床培养)，10000rpm离心1min。
2.用自来水泵吸干上清液，菌体充分悬浮于250μL去离子水中。
3.加250μL2×裂解buffer(20mmol/L Tris-Cl，200mmol/L NaCl，20mmol/L EDTA，1％SDS，pH8.0)和13μL Proteinase K(10mg/mL)，盖紧盖子，上下颠倒5次。
4.37℃水浴保温1h。
5.加入250μL饱和(～6mol/L)NaCl。
6.盖紧管盖，在漩涡振荡器上剧烈振荡30s。
7.冰浴10min。
8.9500rpm离心10min。
9.小心转移500μL上清液至一干净离心管中，加5μL RNaseA(10mg/mL)。
10.37℃水浴保温30min。
11.加1mL无水乙醇，盖紧管盖，上下颠倒直至看清带状沉淀。
12.10000rpm离心5min。
13.用自来水泵吸干上清液，沉淀用70％乙醇洗一次，10000rpm离心2min，再次吸干上清液。
14.沉淀干燥后溶于100μL无菌水(如果溶不掉可再加一些无菌水，但最后体积不能大于300μL)。
15.取10μL琼脂糖凝胶电泳检测，实验原理和实验步骤见附录1，但胶浓度为0.7％，marker为1kb DNA ladder。
五、结果与分析
细菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图形与植物和动物基因组DNA相似。
六、注意事项
1.蛋白酶K消化要彻底。
2.操作时避免机械破坏长链DNA分子。
七、思考题
请简述高盐法提取细菌基因组DNA的实验原理。
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