实验五 从琼脂糖中回收DNA片段
一、实验目的
学习用试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA的方法。
二、实验原理
首先将在胶中的DNA分子释放到溶液中，试剂盒提供了使凝胶溶解的溶液，然后将溶液通过装有一定孔径、与DNA有亲和力的膜(试剂盒提供的柱子)，离心除去溶液，DNA保留在膜上。用不能溶解DNA的溶液将膜洗两次，同样离心除去溶液，洗去杂质，最后用DNA易溶解的溶液将DNA溶解，离心收集到柱子下面的离心管中。
三、实验仪器、材料和试剂
1.仪器:台式高速离心机，微量移液器，枪头(1mL、200μL、10μL)，枪头盒，1.5mL离心管，台式高速离心机和割胶仪(紫外DNA观测仪)。
2.材料:切下的含有特异DNA的琼脂糖凝胶。
3.试剂:试剂盒提供。
四、实验步骤
(一)试剂盒1使用说明
1.切胶并称重，重量与体积的换算关系100mg=100μL
2.根据以下比例加入DE-A:
琼脂糖凝胶浓度≤1.0％，加入3倍体积。
1.0％≤琼脂糖凝胶浓度≤1.5％，加入4倍体积。
1.5％≤琼脂糖凝胶浓度≤2.0％，加入5倍体积。
我们采用的琼脂糖凝胶浓度为0.8％，加入3倍体积的DE-A。
1.混合后在75℃加热直到胶完全溶解，一般需要6～8min，低熔点的琼脂糖用40℃溶解，每2～3min搅拌一次，加热时间勿超过15min。
2.加入0.5倍DE-A量的DE-B，混匀。
3.将步骤4中的混合液移至DNA-prep管中，5500rpm离心1min(如果无沉淀，加快转速，再次离心，将上清液过滤到新的DNA-prep中)。
4.倒掉液体，加入500μL W1，离心1min，弃上清液，加入W2700μL洗涤，5500rpm离心1min，弃上清液，再用W2洗涤一遍。
5.12000rpm离心1min，将膜转移到新的EP管中，加入25～30μL ddH2O于膜中心，室温静置1min，12000rpm离心1min，管中为纯化产物，4℃低温保存，用于连接反应。
(二)Sangon UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒操作步骤
1.通过琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其他DNA片段尽可能分开，然后用干净消毒的手术刀切下含有回收DNA的琼脂糖，放入1.5mL的离心管中。(判定DNA片段的位置时，要尽可能地使用长波长的紫外光，在紫外光下的照射时间要尽可能短。)
2.按400μL/100mg琼脂糖的比例加入Binding BufferⅡ，置于50～60℃水浴中10min，使胶彻底融化(加热溶胶时，每2min混匀一次)。(胶过量时约加500μL。)
3.对于高浓度的胶，可以每100mg的胶加入700μL的Binding BufferⅡ，加热溶胶的时间可以延长到15min，以保证胶全部融化。
4.将融化的胶转移到套放在2mL收集管中的UNIQ-10柱中，室温放置2min，8000rpm室温离心1min．
5.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入到同一收集管中，加入500μL的Washing Solution，8000rpm室温离心1min。
6.重复步骤4一次。
7.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入到同一收集管中，12000rpm室温下离心15s。
8.将UNIQ-10柱放在一个新的1.5mL的离心管中，在柱子膜中央加入40μL Elution Buffer或水(pH＞7)，室温或37℃放置2min。
注意:提高洗脱温度到55～80℃有利于提高洗脱效率。
9.12000rpm室温下离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可以立即使用。实验需要约2h。
五、注意事项
最后加洗脱液时要加在柱子的中央。
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