小片段基因组文库的构建

实验十五　小片段基因组文库的构建

一、实验原理

小片段基因组文库可用来克隆启动子序列或基因组DNA。大肠杆菌质粒的插入片段最大可到7kb，但更多的是几百到2～3kb。转化所用的菌株采用DH10B为好。但是作为掌握实验技术的训练，我们采用常用的pUC19质粒和DH5α菌株。

二、实验设计

(一)过程说明

1.提取pUC19质粒DNA和基因组DNA(材料可根据需要选择，方法可参照实验二、实验四)。

2.对pUC19质粒DNA和基因组DNA用同样的两个粘性末端DNA内切酶进行双酶切。根据DNA的量和酶生产商提供的说明书调节酶量。如果DNA量较多，酶量有限，需要过夜酶切。如果用3mL CTAB提取液从1g植物中提取的DNA溶解在100～150μL。取出适量进行酶切(可取20μL，做30μL的反应体系)。质粒DNA酶切后电泳分离并切出线性片段，用胶回收的方法纯化线性载体片段(参照实验五、实验六)。

3.对线性载体片段和酶切好的基因组DNA进行连接。不同的小组可采用不同的载体与基因组DNA比例(参照实验六)。

4.在进行连接的同时制备DH5α感受态细胞(参照实验七)。

5.将连接好重组质粒、空白的pUC19质粒、纯化的线性载体转化DH5α感受态细胞，在Amp抗性培养基上铺板培养，同时也取一管未转化的DH5α感受态细胞在Amp抗性培养基上铺板培养，做空白对照(参照实验八)。

6.对各个培养皿上长出的菌落数记数分析，计算转化率。

(二)实验流程图

三、结果分析

1.比较重组菌落和正、负对照转化率并进行分析。

2.比较不同载体与基因组DNA比例连接的重组质粒转化数，比较连接效率。

3.分析影响实验结果的因素。