血细胞凝集试验测定流感病毒效价

实验二　血细胞凝集试验测定流感病毒效价

一、实验目的

掌握血凝实验的方法和原理，了解流感病毒具有凝集鸡红细胞的能力，掌握一种病毒类型测定的方法。

二、实验原理

流感病毒表面具有血凝素抗原，具有凝集鸡红血球的能力。当病毒血凝素抗原与红细胞表面相应受体作用后，可导致大量红细胞连接在一起，发生肉眼可见的血球凝集现象。

当病毒血凝素抗原与其特异性抗体发生作用后，血凝素即不再与红细胞结合，血球凝集现象也不会发生。抗原抗体的结合是特异的，因此，由抗体的类型可以推测出病毒的类型。

三、实验材料及器械

(1)收获的尿囊液(即流感病毒)。

(2)1%鸡红血球、0.85%生理盐水。

(3)血凝板、吸管、三角瓶。

四、实验方法及步骤

1.吸取0.9ml生理盐水于血凝板第2孔，从第3孔至第10孔每孔各加生理盐水0.4ml。

2.第1孔加入0.4ml尿囊液，第2孔加0.1ml尿囊液，反复吹打3～4次混匀。

3.从混匀的第2孔中吸取0.4ml至第3孔混匀，再吸0.4ml至第4孔混匀，直到稀释至第9孔;第9孔经稀释吹打后吸出0.4ml，弃去;第10孔为血球对照，即不加尿囊液。以上各孔(从第1孔到第10孔)的病毒的稀释度分别为:原液，1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640，1∶1280，空白对照。

注意事项:

各孔内液体量应均为0.4ml。

4.从第10孔开始，按10→1的方向，向每孔加0.4ml 1%鸡红血球，轻轻振荡均匀，置室温45min后观察实验结果并记录。各孔的总体积应为0.8ml。

五、实验结果判断

血凝结果以+ + + + 、 + + + 、 + + 、 + 、 －表示。

实验结果判断(图2-1):

图2-1　血凝实验结果判断

红细胞均匀分布于孔底者为+ + + + ;

红细胞均分布于孔底，但有卷边现象为+ + + ，即不完全凝集;

红细胞在孔底形成一个小团，边缘光滑圆润者为－ ，红细胞完全未被凝集;

红细胞在孔底形成一个环状，四周有小凝集块者以两个加号++表示。

六、实验结果记录

血凝试验结果

附:血凝效价计算举例

血凝效价计算表

续表

续表

*　4为+ + + + ，3为+ + + ，2为+ + ，1为+ 。

注意事项:

血球凝集试验的血凝滴度是以出现+ +凝集的病毒稀释度表示，这一稀释度病毒液的效价就是一个血凝单位。

七、方法评注

1.背景材料

病毒的毒力指病毒的感染力，即活病毒数，而不包括缺陷病毒颗粒或者已灭活的病毒数量。测定病毒的毒力又称为病毒滴度测定，主要方法有空斑形成单位、TCID50 (半数组织培养物感染剂量)等，具体采用哪种方法要看病毒种类以及敏感细胞。目前测定病毒感染力的常用指标有如下几种:

(1)空斑形成单位:是一种测定病毒感染性比较准确的方法。将适当浓度的病毒悬液接种到生长单层细胞的玻璃平皿或细胞培养瓶中，当病毒吸附于细胞上后，再在其上覆盖一层溶化的半固体营养琼脂层，待凝固后，孵育培养。当病毒在细胞内复制增殖后，每一个感染性病毒颗粒在单层细胞中产生一个局限性的感染细胞病灶，病灶逐渐扩大，若用中性红等活性染料染色，在红色的背景中显出没有着色的“空斑” ，清楚可见。由于每个空斑可以认为是由单个病毒颗粒复制形成，所以病毒悬液的滴度可以用每毫升空斑形成单位(PFU)来表示。

(2 )50%致死量(LD50 )或50%组织细胞病变量(TCID50):该测定法可用来估计所含病毒的感染量。方法是测定病毒感染鸡胚、易感动物或组织细胞培养物，引起50%发生死亡或病变的最小病毒量。具体操作是将病毒悬液作连续10倍稀释，接种于鸡胚、易感动物或组织细胞培养物中，经一定时间后，观察细胞或鸡胚发生病变，如绒毛尿囊膜上产生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感动物发病死亡等，用统计学方法计算50%致死量或50%组织细胞病变量，即可认为是病毒感染性滴度。该方法应用方便，可操作性及重复性强。

TCID50与PFU的换算关系可用下面公式估计:

PFU =0.7×TICD50 (注:该公式仅作为病毒感染力指标的估算公式，不能用于正式文章中)

(3)MOI:病毒感染复数，MOI为multiplicity of infection的缩写，中文译为感染复数。MOI源于噬菌体感染细菌的研究，其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，即平均每个细菌感染噬菌体的数量。一般认为MOI是一个比值，没有单位。由于噬菌体的数量单位为pfu，因此可认为其隐含的单位是pfu number/cell。后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值，即感染病毒与细胞数量的比值，没有单位。

(4)其他方法:如血凝实验等。血凝实验是测定流感病毒效价的最常用的方法之一。

病毒的血凝现象大致可以分为3种类型。

(1)可逆型:血凝素与病毒颗粒结合松，易分开，经超速离心后，病毒颗粒沉淀于管底，血凝素则游离于上清液内。这种血凝素凝集红细胞的现象是可逆的，即被凝集的红细胞释放了吸附于表面的血凝素后，可再与该血凝素发生凝集，如天花、鼠疫等病毒。

(2)不可逆型:血凝素与病毒颗粒结合得比较紧密，如不经过特殊处理，血凝素与病毒颗粒不能分开，这种病毒引起的红细胞凝集，往往是不可逆转的，即当病毒颗粒从红细胞表面游离出来后，红细胞已经不能再与病毒结合，其受体已被破坏。这是由于在一定的温度(37℃)下，病毒释放出一种能破坏红细胞表面受体糖苷键的N-乙酰神经氨酸酶，这样导致当病毒颗粒从红细胞表面游离出来后红细胞表面受体已被破坏而失去了再凝集病毒的能力，如流感病毒、鸡新城疫病毒等。

(3)凝集条件严格型:某些病毒或其血凝素凝集红细胞的条件十分严格，有些甚至不仅对不同种动物的红细胞有严格的选择，即使对同种动物，由于性别和年龄的不同，对红细胞的凝集性能亦有差异。如流行性乙型脑炎，其对公鹅的红细胞凝集能力比对经产老龄母鹅的红细胞凝集能力要强;除此之外，病毒颗粒或其血凝素凝血时对缓冲液的pH值、温度及盐浓度等的要求也很严格。

2.影响因素

红细胞浓度、稀释液种类和pH值等因素均会对血凝实验造成影响。影响血凝和血凝抑制试验的主要因素有:

(1)酸、碱和沉着的红细胞均会影响血凝实验。因此实验室使用的玻璃器材及血凝板均要洁净。

(2)红细胞有动物的种类及个体差异性，因此同批实验应使用同批红细胞。滴定双份血清、抗原分析或比较动物群体抗体水平时应安排在同一次试验进行，以免材料的不同而影响实验结果。另外，更为重要的是，假如出现红细胞变色和污染就不能使用。

(3)病毒或者血凝素反复多次冻融也会导致血凝效价的降低。

(4)血清中非特异性抑制因素会影响实验结果，故试验前一定要用白陶土或冷丙酮处理。血清在加温或保存过程中一旦出现沉淀也容易引起非特异性凝集，这可通过离心来除去。

(5)判定结果一定要在规定的时间观察，每次试验应在一定的温度下进行，如流感病毒在37℃时会从红细胞表面释放出来，因此，炎热的夏天最好在4℃下观察结果。