实验十 血凝素基因的酶切及回收纯化
一、实验目的
掌握用限制性内切酶获得特异DNA片段的方法。
二、实验原理
限制性内切酶是分子生物学研究者在分子生物学操作过程中所使用的基本工具。
限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之上或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)功能且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成:一种为限制性内切核酸酶(限制酶)，它切割某一特异的核苷酸序列;另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ类酶中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如 EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'-G↓AATTC-3')。有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段，称粘性末端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。
如果采用两种限制性内切酶，要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液，则可同时酶切。若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶酶切。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置－70℃低温冰箱30min，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。
三、实验材料
(1)质粒DNA (提取)、原核表达载体。
(2)限制性内切酶XbaI和SalI及其缓冲液、乙酰化BSA。
(3)水浴锅、tip头、Eppendorf管、微量加样器。
四、实验步骤
(1)酶切(目的片段以及载体):按照以下加入试剂，用XbaI 和SalI双酶切从pGEM-T/HA上回收HA基因片段。
pGEM-T/HA(或者原核表达载体) 10μl
限制性内切酶(XbalⅠ和SalⅠ)各 2μl
10×Buffer 5μl
乙酰化BSA 2μl
补加ddH2O至50μl
37℃反应5h以上。
(2)加入10×上样缓冲液，电泳检验酶切结果。
(3)用玻璃粉法或者吸附柱法回收酶切后的DNA片段以及酶切后的载体片段(回收方法见实验五)，－20℃保存备用。
五、技术要点
(1)限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是稳定的。浓缩的限制性内切酶可在使用前以1×限制酶缓冲液稀释，切勿用水稀释，以免酶变性。
(2)尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。
(3)影响限制性内切酶反应的因素很多，DNA制品中的污染物(如蛋白质、酚、氯仿和乙醇)以及残存的EDTA、SDS和高盐浓度等均可能抑制酶切活性。这种抑制可以通过进一步纯化、增加酶量、增大体积或延长反应时间加以克服。
(4)消化超螺旋DNA较线状DNA需要酶的量大。
(5)通常延长时间可使所需的酶量减少。
(6)在做大量DNA酶切时可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测酶切进程。
(7)在反应条件不适时，如过高的酶量(＞25mmol/L)、高甘油含量(＞5%)、高pH (pH＞8.0)、有机溶剂(如DMSO，乙醇等)和Mn2+、Cu2+、Ca2+、Zn2+等二价阳离子，会导致某些内切酶会出现“星号”活性，即其切割特异性发生改变。因此反应条件一定要严格，避免星号活性出现。
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