蛋白质的定点诱变

实验二十一　蛋白质的定点诱变

一、实验目的

掌握通过DNA定点突变来改变蛋白质结构与功能的方法。

二、实验原理

在特定DNA片段内引入点突变。将目的片段克隆进一个高拷贝的载体。两条寡核苷酸引物，如M13的正反引物(F和R)的位置位于克隆位点的侧翼。在两个独立的PCR反应中，用侧翼引物和含有待引入的点突变的寡核苷酸(引物F和3，R和4)扩增点突变的上游片段(A～M)和下游片段(M～C)，以适当的限制性内切酶消化扩增的片段，并产生平末端。这些片段经连接而亚克隆至一已切割的适当载体，转化入大肠杆菌。所得质粒含有一插入片段，该片段除了引入的点突变外，与原DNA完全一样。(B)显示其序列含有一个点突变的寡核苷酸。注意，在引物的5'末端没有“夹子”序列。

三、实验材料

(1)待诱变的DNA带有突变位点的寡核苷酸引物。

(2)大肠杆菌DNA聚合酶I的Klennow片段、合适的限制性内切酶、Taq酶。

四、实验步骤

1.制备模板DNA

(1)利用突变区两侧的限制性内切酶位点将待诱变的DNA片段亚克隆进高拷贝数的载体中。

(2)用少量制备的质粒提取模板DNA，用TE缓冲液重悬100ngDNA至浓度为1ng/μl。

2.合成和纯化寡核苷酸引物并对5'末端磷酸化

寡核苷酸引物应至少有15个以上的碱基与模板DNA同源，引物不用加4个碱基的“夹子”序列。

3.扩增模板DNA

在最后一次延伸结束后，加5U的Klenow酶，30℃保温15min。

(1)往两个500μl微量离心管中加入下列试剂，其中一管加寡核苷酸1，另一管加寡核苷酸2。

10μl (10ng)模板DNA;

10μl 10×扩增反应缓冲液;

10μl 2mmol/L4种dNTP混合液;

1μl (500ng)寡核苷酸1或2 (终浓度100pmol/L);

1μl (500ng)适当的M13侧翼序列引物，正向或反向(终浓度100pmol/L)加水至99.5μl;

0.5μl TaqDNA聚合酶(50/μl)。

(2)按下列条件在自动热循环仪上扩增20～25个循环。

45s　　　　　+93℃(变性)

2min　　　　　50℃(杂交)

2min　　　　　70℃(延伸)

在最后一个循环结束后，于72℃保温10min。

4.分析并处理反应产物

(1)取4μl进行非变性琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，以验证扩增反应是否已产生了预期的产物。

(2)吸取石蜡油，并用氯仿抽提1次以去掉剩余的石蜡油。酚抽提和乙醇沉淀。

5.取所得扩增片段的一半量用侧翼序列内的限制性内切酶切割，琼脂糖凝胶电泳回收纯化酶切片段(操作步骤见实验五)。

6.将两个扩增的片段通过T载体连接亚克隆入适合的载体(操作步骤见实验六)。

7.将质粒转化入大肠杆菌，少量制备质粒DNA (操作步骤见实验七与实验八)。

8.通过DNA测序分析扩增的片段部分，以证实突变已经引入。

9.将突变成功的基因重新克隆到大肠杆菌表达载体(操作步骤见实验十一)。

10.建立突变蛋白的原核表达系统并表达纯化(操作步骤见实验十二)。

11.蛋白质定点突变的检测:测定突变蛋白质及野生形蛋白质的N-末端(操作步骤见实验二十二)。