二、比色分析法及分光光度计的使用
分光光度法是根据物质对光选择性吸收而进行分析的方法。分光光度法具有较高的灵敏度和一定的准确度，特别适宜于微量成分的测定，并具有操作简便、快速、适用范围广等特点，在生物化学中占有重要的地位。
吸光光度法使用的仪器，主要由如图1-4所示的五部分组成。目前，常用的581G光电比色计，72型、721型、722型及751G型等分光光度计，都是在上述五个部件的基础上，增加了灵敏度、准确度、稳定性和各种自动化装置的、具有不同性能的分光光度计。
下面主要介绍751G分光光度计的构造和使用方法。
图1-4 吸光光度法的基本组成部件
（一）构造
751G型分光光度计是可见光和紫外光分光光度计，其波长范围为200～1000nm，在波长为300～1000nm范围内用钨灯作光源，在波长为200～320nm范围内用氢灯作光源。因此可广泛用于测定紫外光区、可见光及近红外区有吸收光谱的物质，进行定性及定量分析。
751G型分光光度计为20世纪70年代产品。80年代以来，随着科学技术的发展，各种新型产品不断涌现，新型仪器操作方便，有自动显示测定数字及打印装置等如53WB紫外可见光分光光度计。考虑到目前更普遍使用的还是751G型，因此本教材仍着重介绍它的使用方法。仪器结构图如图1-5所示。
图1-5 751G型分光光度计结构示意图（正视）
（二）使用方法
1．将751G型分光光度计与稳压电源相连，插上电源插头。
2．仪器主机有2个光源，根据使用波长可选用氢灯或钨灯，拨动主机背面的光源选择杆到所需的光源方向，使光源灯置于光路中。
3．在打开仪器的各种开关前，仔细检查各种开关及旋钮是否均处于关闭位置，打开稳压电源，当电压达到220V时，再打开放大器电源和所需的灯源开关，仪器预热20min，当氢灯稳压电源工作电流达到300mA时仪器即可正常工作。
4．选用比色杯，350nm以上用玻璃比色杯，350nm以下用石英比色杯。将待测溶液（1个空白液，3个被测液）盛入比色杯中约为杯体积的3/4，不要太满，以免拉动试样选择手柄时比色杯中液体溢出，损坏仪器。用擦镜纸将沾在比色杯外的液体擦净。将比色杯垂直放入比色架上，打开样品室盖5，使比色架对准暗箱的钉梢放稳后，盖上样品室盖。移动试样选择手柄7，使装空白液体的比色杯移入光路中。注意，移动滑板应处于定位槽中。
5．转动波长选择旋钮10至波长分度盘对准所需波长。
6．根据测定波长选择光电管。波长为200～625nm时选用蓝敏光电管，将光电管选择手柄8推入。波长为625～1000nm时选用红敏光电管，则将光电管选择手柄8拉出。
7．将选择开关12由关闭位置拨至校正位置后调节暗电流旋钮14，使电表2指针对准“0”位置。为了使测定正确，每测量一次均应用暗电流旋钮校正电表2，使指针在“0”的位置。
8．调节灵敏度旋钮13，在正常情况下，从关闭位置起沿顺时针方向转动3～5圈。
9．转动读数电位器旋钮11，使测量读数盘光吸收准确处于“0”的位置（透光率为100％）。
10．将选择开关拨到“×1”的位置，拉开光门旋钮6，使单色光进入光电管（此时绝对不要打开样品槽盖5以保护光电管），这时电表指针偏移“0”位，用狭缝调节旋钮4，使电表指针大致到达“0”位附近，再用灵敏度旋钮13仔细调节，使电表指针正确地指在“0”位置上。
11．完成上述操作后，立即拉开试样选择手柄7。使第二个待测样品的比色杯处于光路中。注意，滑板应准确位于定位槽中，此时电表指针偏离“0”位，旋转读数电位器旋钮11，使电表指针重新对准“0”位，立即从测量读数盘1上读出光吸收值（A）。再拉出试样选择手柄7，读取第二、第三个样品溶液的光吸收值。
12．完成上述测量后，立即关上（推入）光门旋钮6，以保护光电管，只有处于这种状态才能打开样品槽盖，更换待测溶液，使空白样品处于光路中，重复第7～12步骤，继续测定。
13．当被测定溶液光吸收值大于1.0，透光率小于10％时，把选择开关12拨到“×0.1”的位置上，转动读数电位器旋钮，重新读数，读得光吸收值应加上1.0，透光率则除以10。
14．测定完毕，将每个开关、旋钮、手柄等恢复原状（均处于关闭状态），拔掉电源插头以切断电源，盖好仪器罩。
（三）注意事项
1．若外电路电压波动较大，应外接一台电压稳压器，以增加仪器的稳定性。
2．比色杯误差的校正：在4个比色杯中注入蒸馏水，在相同波长下测定4个比色杯的光吸收值。若相互间差异较大，则应在读数后加上或减去相应差值。
3．比色杯的清洗，用0.1mol/L HCl和乙醇溶液浸泡去污，用蒸馏水充分清洗干净、晾干备用。
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