蛋白质紫外吸收和浓度对照表

三、紫外分光光度法

（一）实验目的

1．了解紫外分光光度法测定蛋白质浓度的基本原理。

2．掌握紫外分光光度法测定蛋白质浓度的基本实验方法。

（二）实验原理

由于蛋白质分子结构中的芳香族氨基酸（如酪氨酸和色氨酸）的残基中含共轭双键，因此蛋白质具有紫外吸收性质，对280nm的紫外光有最大的吸收。在此波长范围内，蛋白质溶液的吸光度与蛋白质的浓度成正比，可用作定量测定。

紫外分光光度法定量测定蛋白质的主要优点是迅速、简便、样品消耗小且低浓度的盐类不干扰测定，因而在蛋白质和酶的制备中，尤其是在柱层析分离、纯化蛋白质和酶制剂中被广泛采用。其缺点是定量测定的准确度较差，究其原因主要是：样品中含有核酸等紫外吸收物质，会出现较大干扰，虽然经过校正，但仍有一定误差；被测蛋白质若与标准蛋白质在氨基酸组成上差异较大（主要是酪氨酸和色氨酸含量），也将产生一定的误差。

（三）实验药品、实验设备

1．血清：人血清，用蒸馏水稀释10倍。

2．1g/L酪蛋白标准液：准确称取用微量凯氏定氮法校正的酪蛋白，用蒸馏水精确配制成1g/L的溶液。

3．紫外分光光度计。

4．试管。

5．刻度吸管。

6．试管架。

（四）实验方法

1．标准曲线的绘制

取8支试管、编号，按表2-13所示顺序和剂量加入各试剂。

表2-13　紫外分光光度法工作曲线的绘制

试剂加完后混匀，用紫外分光光度计在280nm波长下，以“0”管试液作参比溶液调零，测定各管吸光度。

以各吸光度为纵坐标，各标准蛋白浓度为横坐标，绘制吸光度-蛋白质浓度标准曲线。

2．血清测定

取两支试管编号，按表2-14所示顺序和剂量加入试剂，混匀，用紫外分光光度计在280nm波长下，以空白管试液作参比液，测定测定管吸光度。

表2-14　血清中蛋白质浓度的紫外分光光度法测定

3．结果处理

根据测定管的吸光度，在标准曲线上查出对应的标准蛋白质的浓度，再乘以稀释倍数，即为血清中蛋白质浓度。

4．注意事项

（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。

（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等紫外光吸收物质，会出现较大干扰。

（3）因为蛋白质的紫外吸收高峰常随pH值的改变而变化，故在应用本法时要注意溶液的pH，应与标准曲线制作一致。

（五）实验记录

1．吸光度-蛋白质浓度标准曲线的绘制。

2．实验记录：

（六）思考题

1．本法与其他蛋白质定量法相比，有哪些优缺点？

2．如何消除核酸类物质的干扰？