微生物的提取

二、微生物DNA的提取

（一）实验原理

为了研究微生物中遗传物质DNA的生物、化学和物理特性，必须分离得到具有高度聚合态的天然DNA。

由于细菌具有坚韧的细胞壁，有的细菌对十二烷基磺酸钠（SDS）有抗性，因此可先用溶菌酶溶解细胞壁，然后再用SDS处理，使菌体进一步溶解而释放出核酸与蛋白质。另外SDS具有抑制脱氧核糖核酸酶的作用并使部分蛋白质变性。溶菌后所得的高黏度悬液在pH值为8.2的水饱和酚的作用下，可以使DNA活性不丧失而蛋白质变性，离心去除变性蛋白质。但必须注意细菌细胞中含有大量的RNA，如要得到较纯的DNA可用核糖核酸酶处理，使RNA降解而除去，也可用异丙醇选择性的沉淀DNA，而RNA留在溶液中，最后用95％乙醇作沉淀剂而得白色纤维状的DNA。

（二）实验药品

1．0.15mol/L NaCl-0.1mol/L EDTA溶液，pH值为8.0。称取8.76g氯化钠，37.2g乙二胺四乙酸二钠，溶于800mL蒸馏水中，并以NaOH调至pH8.0，定容到1000mL；

2．Tris-SDS缓冲液：pH值为9.0，0.1mol/L Tris（三羟甲基氨基甲烷）缓冲液中含有1％SDS和1mol/L氯化钠；

3．水饱和酚：新鲜重蒸酚用水饱和后，用5mol/L NaOH调至pH值为8.2；

4．SSC溶液：含0.15mol/L氯化钠和0.015mol/L柠檬酸三钠的溶液，pH值为7.0；

5．0.1×SSC溶液：取SSC溶液用蒸馏水稀释10倍即成；

6．10 SSC溶液：含1.5mol/L氯化钠和0.15mol/L柠檬酸三钠的溶液；

7．结晶溶菌酶：（生化试剂，活力10，000～20，000单位），以氯化钠-乙二胺四乙酸二钠（pH值为8.0）溶液配成2mg/mL的酶液；

8．结晶牛胰核糖核酸酶（RNase，生化试剂），以0.1mol/L氯化钠-0.01mol/L pH值为5.4醋酸盐缓冲液配成2mg/mL的酶液，使用前此酶先在80℃水浴中加热10min进行预处理，使污染的脱氧核糖核酸酶失去活性；

9．干冰；

10．NaCl（C.P.）；

11．70％乙醇，95％乙醇。

（三）实验方法

1．枯草杆菌（B.Subtilis）的培养：在20个250mL三角烧瓶内分别加30mL肉汤培养基，在1.05kg/cm²（温度为121℃）灭菌15min，冷却后接种，在37℃摇床上动态培养12～15h。

2．菌体收集及洗涤：将枯草杆菌培养液合并在冰水浴中预冷，经3000r/min离心20min，弃去上清液，以预冷的25mL氯化钠-乙二胺四乙酸二钠（pH值为8.0）溶液洗涤菌体，经3000r/min离心20min，弃去上清液。

以少量氯化钠-乙二胺四乙酸二钠（pH值为8.0）溶液将菌体完全转移到已称重的刻度离心管中（重量记为W₁），经3000r/min离心20min，小心吸去上清液后称重（重量记为W₂），计算出湿菌体重量W。

3．溶菌：加入与湿菌体同体积的2mg/mL溶菌酶溶液，搅匀后在37℃水浴中保温10～20min，当菌液开始发黏时取出，倒于50mL烧杯中，立即将烧杯放入干冰浴中冷冻。按1g湿菌体加8mLTris-SDS缓冲液的比例把缓冲液加入到已冷冻的菌体中，用玻棒捣碎，使成悬浮液。在60℃水浴中使此悬浮液温热到完全融化。溶菌完成后得到黏稠状溶液。

4．酚去蛋白质：已溶菌的悬浮液置于带磨口塞的细口瓶中，加入等体积的水饱和酚，在4℃下手摇20min，得到乳浊液于3000r/min离心15min，离心后分三层，上层液相含有DNA，中间为变性蛋白质，下层为酚层。小心吸出上层液相，量其体积，再加等体积的水饱和酚抽提去蛋白质。如此反复3～4次直至中间蛋白质层极少或消失为止。小心吸出上层水相，并量其体积。

5．核糖核酸酶去RNA：在含DNA的上层水相中，加经预处理过的2mg/mL核糖核酸酶溶液使此酶的最终浓度为50μg/mL，混合液在37℃下保温30min，冷却后再加等体积的水饱和酚，4℃下摇动10min，离心后，收集含有DNA的上层水相，量其体积。

6．DNA的沉淀：加2倍于DNA溶液体积的预冷95％乙醇，即有白色纤维状的DNA沉淀析出，以玻棒缓慢转动，白色纤维状的DNA即缠绕于玻棒上。

DNA沉淀分别在70％、95％乙醇中洗涤后，压干，将此DNA放入试管内，加4mL0.1SSC溶液，待DNA溶解后补加0.4mL 10 SSC溶液，使DNA成1 SSC溶液。

7．含量测定：改良二苯胺法测定DNA含量（见实验八中二），Folin-酚试剂法测蛋白质含量（见实验五中第二点）。计算出每克湿菌体中DNA的含量及DNA制品中蛋白质的含量。

（四）实验记录

1．DNA含量测定（见实验八中第二点）。

2．Folin-酚试剂法测定蛋白质含量（见实验五中第二点）。