氨基酸的分离鉴定

实验一　氨基酸的分离鉴定——滤纸层析法

实验目的

（1）通过实验操作，了解氨基酸的滤纸层析法的原理。

（2）掌握氨基酸的滤纸层析法的操作方法。

实验原理

层析法是指利用混合物中各组分之间物理、化学性质的差异，使各组分以不同程度分布在两相（固定相和流动相）中，从而达到分离。层析法按照其原理可分为分配层析法、吸附层析法、亲和层析法等，滤纸层析法属于分配层析法。在分配层析法中各种物质的分配系数不同，即各种物质在流动相中的浓度和在固定相中的浓度之比不同。分配系数＝物质在固定相中的浓度／物质在流动相中的浓度。

用滤纸作为支持物进行层析的方法，称为滤纸层析法。滤纸层析法所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，水结合在滤纸的纤维之间成为固定相，有机溶剂是流动相。将样品点在滤纸上（此点称为原点），进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速度就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点不等的层析点。

溶质在滤纸上的移动速度用R_f来表示：

只要条件（如温度、展层溶剂的组成）不变，R值是常数，故可根据R值作为定性依据。

氨基酸在层析过程中的分配系数（移动速率）是由它的极性决定的。本实验中，固定相为极性很强的水，流动相为极性弱的有机溶剂，根据相似相溶的原理，极性小的氨基酸在固定相中的溶解度偏小，分配系数小，随着流动相移动的速度快，反之，极性大的氨基酸随着流动相移动的速度慢。

溶剂由下向上移动的，称为上行法（图3-1）；溶剂由上向下移动的，称为下行法。样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的R_f值相同或相近，此时如只用一种溶剂展层，就不能将它们分开。为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转动90°，再用另一溶剂展层，从而达到分离的目的，这种方法称为双向纸法。

利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。

图3-1　上行法分离氨基酸

实验试剂与实验器材

1.实验试剂

（1）标准氨基酸溶液（0.5%）及普通氨基酸混合液。

（2）展层剂：正丁醇∶冰乙酸∶蒸馏水＝4∶1∶5（体积比）。

（3）显色剂：0.1%水合茚三酮的正丁醇溶液。

2.实验器材

层析缸、毛细管、培养皿、层析滤纸、吹风机、小喷壶、针、白线、尺、铅笔等。

实验步骤

（1）平衡：分别取约5mL展层剂置于三个小烧杯中，置于层析缸内，平衡0.5h。

（2）滤纸准备：选用新华1号滤纸，裁成22cm×14cm的长方形，在距纸一端2cm处画一基线，在线上每隔2cm，画五个等距离的点，标上样品名称。

（3）点样：分别用毛细管将各种标准氨基酸溶液及普通氨基酸混合液点在这五个位置上，原点直径不能超过0.5cm，边点边用吹风机吹干。将点好样的滤纸两边缘对齐，用白线缝好，制成圆筒，注意缝线处的滤纸两边不能接触，以免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动太快而造成溶剂前沿不齐。

（4）展层：迅速掀开层析缸，将盛有约20mL展层剂的培养皿迅速置于层析缸内，并将滤纸直立于培养皿中。注意滤纸勿与培养皿壁接触。当溶剂展层至距滤纸上沿1～2cm时，取出滤纸，用铅笔标出前沿位置，用吹风机吹干。

（5）显色：用小喷壶均匀喷洒显色剂，用吹风机吹干。

（6）记录结果：用铅笔轻轻描出各层析点的形状，用直尺量出各层析点中心与原点的距离以及溶剂前沿与原点的距离，求出各氨基酸的R_f值，将各层析点的R_f值与标准氨基酸的R_f值比较，可得知该斑点的准确成分。

注意事项

（1）点样量不能过大，否则会影响R_f值。

（2）注意不要让展层剂过了最上沿。

（3）点样量不能太密集。

（4）展层剂要选择能最适合区分不同成分的组成。

思考题

（1）R_f值怎么计算？

（2）为什么四种氨基酸的R_f值不同？