血清蛋白乙酸纤维薄膜电泳

实验三　血清蛋白乙酸纤维薄膜电泳

实验目的

（1）了解电泳分离蛋白质的一般原理。

（2）掌握乙酸纤维薄膜电泳分离蛋白质技术。

（3）定量测定人血清中各种蛋白质的相对百分含量。

实验原理

电泳是指带正、负电的粒子在电场中分别向相反电极方向移动的现象。其中影响带电粒子泳动速度的因素主要包括：①带电粒子的性质；②电场强度；③溶液的pH值；④离子强度；⑤电渗作用。

蛋白质是两性电解质。在pH值小于其等电点（pI）的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动。在pH值大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有多种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在相同pH值的溶液中所带电荷不同，因此在电场中移动的速度不同，故可利用电泳法将它们分离出来。乙酸纤维薄膜渗透性强，对分子移动无阻力，具有用样量少、分离效果好、无吸附作用、应用广泛和快速简便的优点，目前已被广泛应用在对血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。常见蛋白质的等电点和相对分子质量见表3-1。

表3-1　常见蛋白质的等电点和相对分子质量

续表

实验试剂与实验器材

1.实验试剂

（1）巴比妥缓冲液（pH＝8.6）：巴比妥0.83g，巴比妥钠6.38g，溶于蒸馏水，定容至500mL。

（2）染色液：氨基黑10B5g溶于水（400mL）、甲醇（500mL）、冰乙酸（100 mL）中。

（3）漂洗液：95%乙醇（500mL），冰乙酸（50mL），水（500mL），混合。

（4）人血清。

2.实验器材

乙酸纤维薄膜、电泳仪、电泳槽、滤纸、量筒、载玻片、小镊子（无齿）、烧杯、培养皿。

实验步骤

（1）准备薄膜：将乙酸纤维薄膜剪成8cm×2cm的条状，分清光泽面和无光泽面，然后将该薄膜浸入巴比妥缓冲液中，若薄膜能够迅速湿润，并且色泽深浅一致，则可用于电泳，将薄膜浸泡20～30min。

（2）准备电泳槽：将电泳槽洗净，在两个电泳槽中各倒入等体积的巴比妥缓冲液。

（3）制作滤纸桥：裁剪宽3cm、长6～7cm的两层滤纸条，制作滤纸桥。

在电泳槽支架上分别放两层滤纸条，使滤纸一端与支架的前沿对齐，另一端浸入巴比妥缓冲液中。当滤纸全部湿润后，用玻璃棒挤压滤纸，使其紧贴在电泳槽支架上。

（4）点样：取出乙酸纤维薄膜后，将其夹在滤纸中间，吸去多余的缓冲液，将无光泽面向上平放在洁净滤纸上。用盖玻片蘸人血清少许，在薄膜一端2cm左右处将盖玻片垂直向下轻轻落下，并随之提起。加样力求均匀（可先在普通滤纸上练习点样几次），要求在薄膜上点上细条状的人血清样品。

（5）电泳：将薄膜平悬于电泳槽支架上，使无光泽面向下，薄膜两端与浸在缓冲液中的滤纸桥相贴（不含气泡）（图3-2）。点样端放在电泳槽的阴极端。盖上电泳槽盖，静置平衡5min。接通电源，调节每厘米薄膜电流至0.4～0.8mA，或者调电压至120～160V，电泳时间约为50min（通电时，不许打开电泳槽盖接触缓冲液，以免触电）。

（6）染色：电泳完毕，切断电源，取出薄膜，置于染色液中，染色5min。

（7）漂洗：用漂洗液脱色，少量多次（每次约5min），直至蓝色背景脱尽，即可得电泳图谱。

图3-2　乙酸纤维薄膜电泳示意图

注意事项

（1）薄膜应浸透，点样应均匀，否则电泳图谱不齐，分离不清楚。

（2）注意溶液pH值与等电点的关系，以确定点样端的电极。

（3）漂洗时，漂洗液使用应少量多次。

（4）操作时，手指切勿直接接触薄膜，在取薄膜进行染色、漂洗等步骤时，均应用镊子夹取。

（5）漂洗前，薄膜应彻底干燥，潮湿者不能漂洗。

（6）漂洗后，应待薄膜完全干燥后，再将其从玻璃板上取下，否则薄膜易褶皱。

思考题

（1）在电泳槽的阴极端是什么样品？为什么？

（2）若点样量过大，染色后会看到什么结果？

（3）乙酸纤维薄膜用作电泳支撑物有什么优点？

（4）影响电泳速度的因素有什么？