紫外分光光度法测定蛋白质含量

实验五　紫外分光光度法测定蛋白质含量

实验目的

（1）掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理和操作方法。

（2）掌握紫外分光光度计的使用方法。

实验原理

蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸残基。它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的吸光度与其浓度成正比关系，故可作为蛋白质定量测定的依据，但由于各种蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，故如果要准确定量，必须要有待测蛋白质的纯品作为标准来比较，或者已经知道其消光系数。另外，不少杂质在280nm波长下也有一定吸光能力，可能有干扰作用。其中以核酸（嘌呤和嘧啶）的影响更为严重，然而核酸的最大吸收峰是在260nm，因此溶液中同时存在核酸时，必须同时测定260nm波长时的吸光度（A₂₆₀）与280nm波长时的吸光度（A₂₈₀），然后根据两种波长的吸光度的比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量。

本方法操作简便、迅速，且不消耗样品（可以回收），多用于纯化蛋白质的微量测定。本方法的主要缺点：当待测的样本蛋白质与标准蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量差异较大时，则产生一定误差，混有核酸时必须分别测定280 nm和260nm两处波长的吸光度，再按公式推算蛋白质含量。

实验试剂与实验器材

1.实验试剂

（1）蒸馏水。

（2）1mg／mL牛血清。

（3）待测样本蛋白质：将双缩脲法测定的蛋白质的样品用生理盐水稀释而成（浓度约为1mg／mL）。

2.实验器材

（1）UV-9100型紫外分光光度计。

（2）试管（1.5cm×15cm）（8支）。

（3）试管架。

（4）刻度吸管（0.5mL的1支、1mL的3支、2mL的2支、5mL的2支）。

实验步骤

（1）取试管8支，编号后按表3-2取样。

表3-2　紫外分光光度法测定蛋白质含量

各管内物质混匀，盛于石英杯中，用紫外分光光度计，以空白试管调节零点，分别于280nm波长下测定各管的吸光度。

（2）计算：

①标准曲线法：以标准管各管吸光度（A₂₈₀）为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线，然后根据测定管吸光度值，直接查标准曲线求得样本蛋白质的含量。

②经验公式法：利用经验公式直接计算样本蛋白质的含量。

准确吸取牛血清样本0.1mL，置于50mL容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度，即稀释500倍，在280nm和260nm两处波长时分别测得吸光度，再按下列公式计算。

样本蛋白质含量（mg／mL）＝1.45×A₂₈₀-0.74×A₂₆₀

注意事项

（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差，故该方法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。

（2）核酸在280nm波长处也有光吸收，对蛋白质的测定有干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm波长处。如同时测定样本蛋白质在260nm波长的吸光度，通过计算就可以消除其对蛋白质测定的影响。不过由于不同的蛋白质和核酸的紫外光吸收方式不相同，故虽然经过计算校正，测定结果还会存在一定的误差。

思考题

（1）比较经验公式法和标准曲线法两种计算方法的精确度。

（2）紫外分光光度法测定蛋白质含量的方法有何优点和缺点？受哪些因素的影响和限制？