糖类的薄层层析鉴定

实验二　糖类的薄层层析鉴定

【实验目的】

1．了解并掌握糖类的薄层层析分析原理。

2．学习薄层层析的一般操作及定性与定量鉴定的方法。

【实验原理】

薄层层析是一种广泛应用于氨基酸、多肽、核苷酸、脂肪类、糖类和生物碱等多种物质的分离和鉴定的层析方法。由于层析是在吸附剂或支持介质均匀涂布的薄层上进行的，所以称为薄层层析。

薄层层析的主要原理是根据样品组分与吸附剂的吸附力及其在展层剂中的分配系数的不同而使混合物分离。当展层剂移动时，会带着混合样品中的各组分一起移动，并不断发生吸附与解吸作用以及反复分配作用。根据各组分在溶剂中溶解度的不同和吸附剂对样品各组分吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列的斑点。如果把标准样品在同一层析薄板上一起展开，便可通过在同一薄板上的已知标准样品的Rf值和未知样品各组分的Rf值进行对照，就可初步鉴定未知样品各组分的成分。

薄层层析根据支持物的性质和分离机制的不同分为吸附层析、离子交换层析和凝胶过滤等。糖的分离鉴定可在吸附剂或支持剂中添加适宜的黏合剂后再涂布于支持板上，这样可使薄层粘牢在玻璃板(或涤纶片基)这类基底上。

硅胶G是一种已添加了黏合剂石膏(CaSO₄)的硅胶粉，糖在硅胶G薄层上的移动速度与糖的相对分子质量和羟基数等有关，经适当的溶剂展开后，糖在硅胶G薄层上的移动距离为戊糖＞己糖＞双糖＞三糖。采用硼酸溶液代替水调制硅胶G制成的薄板可提高糖的分离效果。如对已分开的斑点显色，而将与它位置相当的另一个未显色的斑点从薄层上与硅胶G一起刮下，以适当的溶液将糖从硅胶G上洗脱下来，就可用糖的定量测定方法测出样品中各组分的糖含量。

薄层层析的展层方式有上行、下行和近水平等。一般采用上行法，即在具有密闭盖子的玻璃缸(即层析缸)中进行，将适量的展层剂倒于缸底，把点有样品的薄层板放入缸中即可。保证层析缸内有充分展层剂的饱和蒸气是实验成功的关键。与纸层析、柱层析等方法比较，薄层层析有明显的优点:操作方便、层析时间短、可分离各种化合物、样品用量少(0．1至几十微克的样品均可分离)、比纸层析灵敏度高10～100倍、显色和观察结果方便，如薄层由无机物制成，可用浓硫酸、浓盐酸等腐蚀性显色剂。因此，薄层层析是一项常用的分离技术。

【药品试剂】

1．木糖(或棉子糖)、葡萄糖、果糖、蔗糖、混合样品、硅胶G。

2．1%糖标准溶液:取木糖(或棉子糖)、葡萄糖、蔗糖各1g，分别用75%乙醇溶解并定容到100ml。

3．1%糖标准混合溶剂:取上述各种糖各1g，混合后用75%乙醇溶解并定容至100 ml。

4．0．1mol/L硼酸溶液。

5．展层剂:将氯仿和甲醇按照下面比例混合，氯仿∶甲醇=60∶40(V/V)。

6．苯胺-二苯胺-磷酸显色剂:1 g二苯胺溶于由1ml苯胺、5 ml 85%磷酸和50 ml丙酮组成的混合溶液中。

【实验器材】

烧杯、玻璃板(8cm×12cm)、层析缸(15cm×30cm)、毛细管(0．5 mm)、玻棒、喷雾器、烘箱、尺、铅笔、干燥器。

【实验方法】

1．硅胶G薄层板的制备:将制备薄层用的玻璃板预先用洗液洗干净并烘干，玻璃板要求表面光滑。称取硅胶G粉6 g，加入12 ml 0．1 mol/L硼酸溶液，用玻棒在烧杯中慢慢搅拌至硅胶浆液分散均匀，黏稠度适中，然后倾倒在干净、干燥的玻璃板上，倾斜玻璃或用玻棒将硅胶G由一端向另一端推动，使硅胶G铺成厚薄均匀的薄层。待薄板表面水分干燥后置于烘箱内，待温度升至110℃后活化30分钟。冷却至室温后取出，置于干燥器中备用(避免薄板骤热或骤冷，否则容易使薄层断裂或在展层过程中脱落)。制成的薄层板，要求表面平整，厚薄均匀。

手工涂布薄板的方法:

(1)玻棒涂布:选用一根直径为1～1．2 cm的玻璃棒或玻璃管在两端绕几圈胶布，胶布的圈数视薄层的厚度而定，常用厚度为0．56～1 mm，把吸附剂倒在玻璃板上，用这根玻璃棒在玻璃上将吸附剂向一个方向推动，即成薄板。

(2)倾斜涂布:将吸附剂浆液倒在玻璃上，然后倾斜适当角度使吸附剂漫布于玻板上面成薄层。

2．点样:取制备好的薄板一块，在距底边1．5 cm处画一条直线，在直线上每隔1．5～2 cm做一记号(用铅笔轻点一下，切记不可将薄层刺破)，共4个点。用0．5 mm直径的毛细管吸取糖样品量约5～50μg，点样体积约1～1．5μl，可分次滴加，控制点样斑点直径不超过2 mm。在点样过程中可用吹风机冷热风交替吹干样品，也可以让其自然干燥。

3．展层:将已点样薄板的点样一端放入盛有展层剂的层析缸中，展层液面不得超过点样线，层析缸密闭，自下向上展层，当展层剂到达距薄层板顶端约1 cm处时取出薄板，前沿用铅笔或小针作一记号。60℃烘箱内烘干或晾干。

4．显色:将苯胺-二苯胺磷酸显色剂均匀喷雾在薄层上，置85℃烘箱内加热至层析斑点显现，此显色剂可使各种单糖显现出不同的颜色(表1-1)。

表1-1　　单糖在苯胺-二苯胺磷酸显色剂作用下的显色结果

5．结果分析:样品中单糖定性鉴定薄层显色后，记下各斑点的位置、颜色，绘出层析图谱。根据各显色斑点的相对位置，计算Rf值。

将混合样品图谱与标准样品图谱相比较或通过混合样品与标准样品Rf值和呈现颜色的比较，确定混合样品中所分离的各个斑点分别为何种糖。

6．影响Rf值的因素:①展层溶剂的样品组分的性质:样品组分若在固定相中溶解度较大，在流动相中溶解度小，则Rf值小;反之，Rf值大。②吸附剂的性质和质量:不同批号和厂家的产品，其性质和质量不尽相同。③吸附剂的活度。④薄层的厚度。⑤层析槽的形状、大小和饱和度。⑥展层方式。⑦杂质的存在和量。⑧展层的距离。⑨样品量。⑩温度。

由于影响Rf值的因素很多，故不能仅根据Rf值来鉴定未知样品组分。一般采用几种薄层层析法来确证样品的未知组分，如一种用吸附薄层层析，另一种用聚酰胺薄层层析等。实践中，也可把未知样品与标准品混合点样，然后进行薄层层析。如果在几个不同类型的薄层层析中，两者都不发生分离，则可证明这两个化合物是相同的。

【注意事项】

1．制备薄板时，薄板的厚度及均一性对样品的分离效果和Rf值的重复性影响很大，普通薄层厚度以250μm为宜。若用薄层层析法制备少量的纯物质时，厚度可稍增大到500～700μm，甚至1～2 mm。

2．活化后的薄层析在空气中久置会因为吸潮而导致活性降低。

3．用于薄层层析的样品溶液的质量要求非常高。样品中含有盐分会引起拖尾现象，甚至有时得不到正确的分离效果。

4．样品溶液应具有一定的浓度，一般为1～5 g/L，若样品太稀，点样次数太多，就会影响分离效果，所以必须进行浓缩处理。

5．样品的溶剂最好使用挥发性的有机溶液(如乙醇、氯仿等)，不宜用水溶液，因为水分子与吸附剂的相互作用力较弱，当它占据了吸附剂表面上的活性位置时，就使吸附剂的活性降低，从而使斑点扩散。

6．样品点样量不宜太多，若点样量超载(即超过该吸附剂负载能力)，则会降低Rf值，层析斑点的形状被破坏。点样量一般为几到几十微克，体积为1～2μl。

7．展层必须在装闭的器皿中进行，器皿事先应用展层剂饱和，把薄板的点样端浸入展层剂中，深度为0．5～1 cm。千万勿使点样斑点浸入展层剂中。

8．展层剂的选择:

(1)根据溶剂的结构、性质的不同而定，主要以溶剂的极性大小为依据。在同一吸附剂上，溶剂极性越大，对同一性质的化合物的洗脱能力也越强，即在薄层板上把这一化合物推进得越远，Rf值也越大。如果发现用一种溶液只展开某一化合物，并且Rf值太小，则可考虑换用另一种极性较大的溶剂，或在原来的溶剂中加入一定量极性较大的溶液进行展层。溶液极性大小次序如下:水＞甲醇＞正丙醇＞丙酮＞乙酸甲酯＞乙酸乙酯＞乙醚＞氯仿＞三氯甲烷＞苯＞三氯乙烯＞四氯化碳＞二硫化碳＞石油醚。

(2)根据被分离物质的极性和吸附剂的性质而定。在同一吸附剂上，不同化合物的吸附规律是:①饱和碳氢化合物不易吸附或吸附不牢。②不饱和碳氢化合物被吸附，含双键越多，吸附得越牢。③碳氢化合物被一个功能基取代后，其吸附性增大。在薄层上，对于吸附性较大的化合物，一般需用极性较大的溶剂(展层剂)才能推动它。

(3)若样品组分具有酸碱性，则可将展层剂的pH值作适当调整。若样品组分为碱性，则调节展层剂pH值为碱性，以增加展层溶液的分辨率，使样品在薄板上展层后，斑点圆而集中，避免拖尾现象。当样品组分具有酸性时，调节展层剂pH值为酸性，可得到圆而集中的斑点。

9．在薄层层析时，层析缸溶剂饱和度对分离效果影响较大。在不饱和层析缸中，展层易引起边缘效应，因为极性较弱的溶液和沸点较低的溶剂在边缘挥发得快，从而使样品组分在边缘的Rf值高于中部的Rf值，用饱和的层析缸可以消除边缘效应。

10．为了获得更好的薄层层析效果，也可采用双向展层、多次展层和连续展层。

11．薄层层析展开后，对被分离的样品组分进行定性或定量分析，要用不同的显色方法先确定它们的位置。有的物质在紫外灯下可显示出荧光斑点，如核苷酸等;对于在紫处光下不显荧光的样品，可用荧光薄层检出，该薄层的制法是将荧光物质(1．5%硅酸镉粉)加入吸附剂中，或在薄板上喷0．04%荧光钠水溶液、0．5%硫酸奎宁醇溶液及1%磺基水杨酸的丙酮溶液;有的有色物质在展层后可显示有颜色的斑点;对无色化合物的显色，主要采用两种方法，即物理方法和化学方法。物理方法如用紫外灯照射，属非破坏性显色方法。化学方法如用茚三酮显色剂喷雾显色可使氨基酸类化合物显色;对于无机吸附剂制成的薄层，可用强腐蚀性显色剂如硫酸、硝酸或其他混合溶液，因为这些显色剂几乎可使所有有机化合物转变成碳，为破坏性显色方法，此类显色剂称为万能显色剂，但它们不适用于定量测定或制备用的薄层上。

【思考题】

1．硅胶G薄层层析鉴定糖类的原理是什么?

2．本实验在操作过程中有哪些方面是实验成功的关键?

3．分析本实验的层析图谱。