紫外吸收法测定蛋白质含量

实验一　紫外吸收法测定蛋白质含量

【实验目的】

1．掌握紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。

2．掌握蛋白质标准浓度曲线的绘制方法。

3．了解紫外吸收法的优缺点和适用范围。

【实验原理】

蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm处，其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。该法测定范围为0．01～1．0 mg/ml。

样品中核酸对紫外光的吸收会影响蛋白质浓度的测定结果，但核酸的吸收高峰在260nm附近。纯蛋白质的A₂₈₀与A₂₆₀的光吸收比值约为1．8，而纯核酸的A₂₈₀与A₂₆₀光吸收比值约为0．5。通过测定A₂₈₀与A₂₆₀的值，利用经验公式或校正表能大致计算出不纯样品的蛋白质浓度。

紫外吸收法测定蛋白质含量的优点:简便、灵敏、快速，不破坏蛋白质也不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐不干扰测定，如生化制备中常用的硫酸铵和大多数缓冲液等。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。

该方法的缺点在于:测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。虽然可以通过校正表的计算减少核酸的干扰，但测定的结果仍存在一定的误差。

【实验器材】

紫外分光光度计、试管和试管架、微量移液器和枪头。

【药品试剂】

1．浓度为1 mg/ml的标准蛋白溶液。

2．待测蛋白A溶液和B溶液(A为纯蛋白质;B为含核酸的蛋白质)。

【实验方法】

1．绘制蛋白质标准浓度曲线:标记试管，按表3-1依次向试管中加入各溶液，充分混匀。取光径为1 cm的石英比色杯，以“0”管调节零点，测定各管溶液在280 nm处的光吸收值。以蛋白质浓度(mg/mL)为横坐标，光吸收值(A₂₈₀)为纵坐标做标准曲线。

表3-1　　　　　　　紫外吸收法的标准曲线制备表

2．待测蛋白A溶液的浓度测定:将A溶液按1∶2、1∶3、1∶4比例稀释，充分混匀，在280nm波长处分别测定光吸收值，从标准曲线上查出稀释后的蛋白质浓度，乘以稀释倍数后计算A溶液的实际浓度，取平均值。

3．待测蛋白质B溶液的浓度测定:将B溶液按1∶2、1∶3、1∶4比例稀释，充分混匀，在280 nm波长和260 nm波长下分别测定光吸收值，乘以稀释倍数后取平均值，分别得出A₂₈₀和A₂₆₀。利用下述经验公式算出蛋白质浓度:

蛋白质浓度(mg/ml)=1．45×A₂₈₀－0．74×A₂₆₀

4．直接计算A₂₈₀与A₂₆₀的比值，从表3-2中查出校正因子“F”值和样品中混杂的核酸的百分含量，由下述经验公式直接计算出该溶液的蛋白质浓度。

式中:

F——校正因子;

d——石英比色杯的厚度(cm);

N——溶液的稀释倍数。

表3-2　　　　　　　紫外吸收法测定蛋白质含量的校正表

【注意事项】

1．浓度为1%的蛋白质溶液在光径为1 cm时的光吸收值被称作百分吸收系数或比吸收系数A_1%1cm。部分蛋白质在280nm下的A_1%1cm可在文献中查到，因此可以直接准确地计算出蛋白质浓度。例如牛血清蛋白的A_1%1cm为6．3;而溶菌酶的A_1%1cm为22．8。

2．蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50～500 mg/ml的溶液，测定238nm的光吸收值A₂₃₈，绘制标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。此法比280nm吸收法灵敏。但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐、无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再做测定。

【思考题】

1．简单描述紫外吸收法测蛋白质含量的优缺点。

2．简述紫外吸收法的用途。