蛋白质盐析分离

实验十　蛋白质盐析分离

【实验目的】

1．掌握盐析分级分离蛋白质的原理。

2．了解盐析分级分离蛋白质的操作。

【实验原理】

蛋白质是亲水胶体，维持蛋白质胶体稳定的重要因素是水化膜和同种电荷。蛋白质颗粒表面大多为亲水基团，可吸引水分子，使蛋白质分子表面形成一层水化膜，从而阻断蛋白质颗粒的相互聚集，防止溶液中蛋白质的沉淀析出。在蛋白质分子表面的疏水基团附近，水分子极化排列，以避免蛋白质聚集。除此之外，蛋白质胶粒表面带有电荷，也可起稳定胶粒的作用。蛋白质分子表面的可解离基团在适当的pH值条件下，与周围的反离子形成稳定的双电层。水化层、疏水基团附近的极化水分子的存在以及双电层使蛋白质胶体分子在合适的溶液中稳定存在，不会发生沉淀。如果改变溶液的环境，如离子浓度、pH值等，会破坏水化层和双电层，导致蛋白质胶体分子稳定性遭到破坏，蛋白质就会沉淀下来。

低浓度中性盐溶液中，蛋白质溶解度随盐浓度的增加而增加，因为蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用增强，因而溶解度增加。反之，蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象称为盐析。其原理是:中性盐比蛋白质具有更强的亲水性，因此将与蛋白质争夺水分子，使蛋白质脱去水化层;同时高浓度盐离子使蛋白质表面所带的电荷被中和，双电层厚度降低，静电排斥作用减弱，蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。

影响盐析作用的因素包括蛋白质的种类、蛋白质浓度、环境温度、环境pH值以及盐析盐的种类等。蛋白质分子量越大、分子不对称性越大，越容易发生沉淀，沉淀所需的盐量也越少。蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。蛋白质浓度过高的时候，会出现待分离蛋白质和其他蛋白质一起沉淀即共沉淀现象。蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白质的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。因此，盐析时蛋白质含量以2．5%～3%为宜，过高时需用生理盐水稀释。盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。血清蛋白于25℃时较0℃更易析出。但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。在低离子强度的溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范围内随温度升高而增大;但在高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水沉淀。一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。在接近蛋白质等电点的溶液中进行盐析有利于蛋白质的沉淀。

盐析用的盐要求具有较强的盐析作用;足够大的溶解度，适于低温操作;生物惰性，不会使蛋白质变性;密度小且来源丰富。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH值不同，故可用于对混合蛋白质组分的分离。

盐析分离沉淀的蛋白质中含有大量中性盐，影响蛋白质的后续应用，因此可以用透析法、超滤法或者凝胶层析法进行脱盐处理。

硫酸铵浓度的计算和调整常用的公式如下，也可以通过查阅附件中硫酸铵饱和度表格进行添加。

(1)加硫酸铵饱和液:V=V₀(S₂－S₁)/(1－S₂)

其中，V表示所加饱和硫酸铵的体积;V₀表示原溶液的体积;S₂表示所需达到的硫酸铵饱和度;S₁表示原溶液硫酸铵的饱和度。

(2)加固体硫酸铵:t=G(S₂－S₁)/(1－AS₂)

其中，t表示每升溶液加入的克数;G和A均为常数，0℃时，G为507，A为0．27;20℃时，G为533，A为0．27;S₂表示所需达到的硫酸铵饱和度;S₁表示原溶液硫酸铵的饱和度。

【实验器材】

50 ml烧杯1个、玻璃搅拌棒、10 ml离心管2个、1．5 ml的离心管、离心机等。

【药品试剂】

1．蛋清。

2．饱和硫酸铵溶液:称取分析纯(NH₄)₂SO₄400～425 g，以50～80℃的蒸馏水500 ml溶解，搅拌20分钟，趁热过滤。冷却后以浓氨水(15 mol/L的NH₄OH)调pH值至7．4。配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。

3．固体硫酸铵。

【实验方法】

1．在10 ml离心管中加入2 ml稀释以后的蛋清，然后加入2 ml饱和硫酸铵溶液。充分混合均匀，静置3～5分钟使蛋白质析出。

2．3000 r/min离心5分钟。

3．用移液枪吸取上清液至另一个离心管中，并用4 ml水充分溶解沉淀。沉淀中含卵球蛋白，上清液中含分子量较小的卵清蛋白。

4．测量上清液体积，加入固体硫酸铵，使溶液达饱和，离心获得分子量较小的卵清蛋白。

【注意事项】

1．对未知性质的蛋白质，如果不知道该蛋白质在多少浓度的硫酸铵中沉淀，就需要从20%开始递增硫酸铵浓度，逐级沉淀蛋白，随后再进行鉴定。

2．盐析实验获得的卵球蛋白和卵清蛋白只是蛋白质纯化中的粗体物，其中含有很多种的杂蛋白，需要进行进一步的纯化才能获得纯的卵球蛋白和卵清蛋白。

【思考题】

沉淀蛋白质的方法有哪些?盐析法有何优势?