纤维素柱层析纯化酶蛋白

实验十二　DEAE纤维素柱层析纯化酶蛋白

【实验目的】

1．离子交换柱层析进一步纯化蔗糖酶蛋白。

2．掌握离子交换层析的原理和注意事项。

【实验原理】

离子交换层析的原理是带电的生物大分子和离子交换柱填料上的离子基团进行交换而被分离纯化。以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离。能够分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等。选择离子交换剂(阴离子或阳离子交换剂)，决定于被分离物质在所用缓冲液pH值下所带的电荷性质。如pH值高于蛋白质等电点，应选阴离子交换剂，反之应选阳离子交换剂。交换剂的基质是疏水性还是亲水性，对被分离物质有不同的作用，因此对被分离物质的稳定性和分离效果均有影响。在分离生命大分子物质时，选用亲水性基质的交换剂较为合适，它们对被分离物质的吸附和洗脱都比较温和，活性不易破坏。

离子交换剂的种类很多，最常用的是DEAE-纤维素、CM纤维素和离子交换交联葡聚糖。一般情况下，DEAE-纤维素用于分离酸性蛋白质，而CM纤维素用于分离碱性蛋白质。

在离子交换层析前要注意使离子交换剂带上合适的平衡离子，使平衡离子能与样品中的组分离子进行有效的交换。如果平衡离子与离子交换剂结合力过强，会造成组分离子难以与交换剂结合而使交换容量降低。另外还要保证平衡离子不对样品组分有明显影响。在分离过程中，平衡离子被置换到流动相中，它不能对样品组分有污染或破坏。如在纯水制备过程中用到的离子交换剂的平衡离子是H或OH离子，因为其他离子都会对纯水有污染。但是在分离蛋白质时，一般不能使用H或OH型离子交换剂，因为分离过程中H或OH离子被置换出来都会改变层析柱内pH值，影响分离效果，甚至引起蛋白质的变性。

【实验器材】

层析柱、部分收集器、磁力搅拌器及搅拌子、50 ml小烧杯2个、玻璃砂漏斗、水泵与抽滤瓶、精密pH试纸或pH计、三通管、止水夹、吸耳球、石英紫外比色杯、尿糖试纸、点滴板、导率仪。

【药品试剂】

1．DEAE纤维素:DE-23 1．5 g。

2．0．5 mol/L NaOH100 ml。

3．0．5 mol/L HCl 50 ml。

4．0．02 mol/L pH7．3 Tris-HCl缓冲液250 ml。

5．0．02 mol/L pH7．3(含0．2 mol/L NaCl)的Tris-HCI缓冲液50 ml。

【实验步骤】

1．离子交换剂的处理:称取1．5 g DFAE纤维素(DE-23)干粉，加入0．5 mol/L NaOH溶液(约50 ml)，轻轻搅拌，浸泡至少0．5小时(不超过1小时)，用玻璃砂漏斗过滤，并用去离子水洗至近中性，抽干后，放入小烧杯中，加50 ml的0．5 mol/L HCl，搅匀，浸泡0．5小时，用去离子水洗至近中性，再用0．5 mol/L NaOH重复处理一次，用去离子水洗至近中性后，抽干备用(因DEAE纤维素昂贵，用后务必回收)。实际操作时，通常纤维素是已浸泡过并回收的，按“碱-酸”的顺序洗即可，因为酸洗后较容易用水洗至中性。碱洗时因过滤困难，可以先浮选除去细颗粒，抽干后用0．5 mol/L NaOH-0．5mol/L NaCl溶液处理，然后水洗至中性。

2．装柱与平衡:先将层析柱垂直装好，在烧杯内用0．02 mol/L pH7．3 Tris-HCl缓冲液洗纤维素几次，用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱，然后用此缓冲液洗柱至流出液的电导率与缓冲液相同或接近时即可上样。

3．上样与洗脱:上样前先准备好梯度洗脱液。本实验采用20 ml的0．02 mol/L pH7．3的Tris-HCl缓冲液和20 ml含0．2 mol/L浓度NaCl的0．02 mol/L pH7．3的Tris-HCl缓冲液，进行线性梯度洗脱。取两个相同直径的50 ml烧杯，一个装20 ml含NaCl的高离子强度溶液，另一个装入20 ml低离子强度溶液，放在磁力搅拌器上，在低离子强度溶液的烧杯内放入一个小搅拌子(在细塑料管内放入一小段铁丝，两端用酒精灯加热封口)，将此烧杯置于搅拌器旋转磁铁的上方。将玻璃三通插入两个烧杯中，上端接一段乳胶管，夹上止水夹，用吸耳球小心地将溶液吸入三通(轻轻松一下止水夹)，立即夹紧乳胶管，使两烧杯溶液形成连通，注意两个烧杯要放妥善，切勿使一杯高、一杯低。

样品小心地加到层析柱上，不要扰动柱床，注意要从上样开始时使用部分收集器收集，控制流速每10分钟2．5～3 ml。上样后用缓冲液洗两次，然后再用约20 ml缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质，至A₂₈₀降到0．1以下，夹住层析柱出口，将恒流泵入口的细塑料导管放入不含NaCl的低离子强度溶液的小烧杯中，用胶布固定塑料管，接好层析柱，打开磁力搅拌器，放开层析柱出口，开始梯度洗脱，连续收集洗脱液，两个小烧杯中的洗脱液用尽后，为洗脱充分，也可将所配制的剩余30 ml高离子强度洗脱液倒入小烧杯继续洗脱，控制流速每10分钟2．5～3 ml。测定每管洗脱液的A₂₈₀光吸收值。

【注意事项】

1．离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和柱长比一般为1∶10到1∶50之间，层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整，不能有气泡。

2．平衡缓冲液中离子强度和pH值的选择首先要保证各个待分离物质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。注意平衡缓冲液中不能有与离子交换剂结合力强的离子，否则会大大降低交换容量，影响分离效果。选择合适的平衡缓冲液，可以直接去除大量的杂质，并使得后面的洗脱有很好的效果。

3．上样时应注意样品液的离子强度和pH值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的1%～5%为宜，以使样品能吸附在层析柱的上层，得到较好的分离效果。

4．在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变pH值两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来;而改变pH值的洗脱，对于阳离子交换剂一般是pH值从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是pH值从高到低。由于pH值可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般采用改变离子强度的梯度洗脱。

5．洗脱液的选择首先也是要保证在整个洗脱液梯度范围内，所有待分离组分都是稳定的。其次是要使结合在离子交换剂上的所有待分离组分在洗脱液梯度范围内都能够被洗脱下来。另外可以使梯度范围尽量小一些，以提高分辨率。

6．洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果，洗脱速度通常要保持恒定。一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好，但洗脱速度过慢会造成分离时间长、样品扩散、谱峰变宽、分辨率降低，所以要根据实际情况选择合适的洗脱速度。如果洗脱峰相对集中于某个区域造成重叠，则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率;如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。

【思考题】

1．简述离子交换层析的原理和用途。

2．试分析影响离子交换层析分离效果的因素有哪些。