蔗糖酶的盐析和凝胶层析脱盐

实验八　蔗糖酶的盐析和凝胶层析脱盐

【实验目的】

1．掌握蛋白质盐析的原理。

2．了解并熟练掌握凝胶层析脱盐的操作方法。

【实验原理】

用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。经透析或用水稀释时又可溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。分子量大的蛋白质(如球蛋白)比分子量小的(如白蛋白)易于析出。改变盐浓度，可使不同分子量的蛋白质分别析出。通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等。硫酸铵浓度的计算与调整:

(1)加硫酸铵饱和液:V=V₀(S₂－S₁)/(1－S₂);

(2)加固体硫酸铵:t=G(S₂－S₁)/(1－AS₂)

V为所加饱和硫酸铵体积;V₀为原溶液体积;S₂为需达到的硫酸铵饱和度;S₁为原溶液硫酸铵饱和度;G和A为常数，0 e时G为507，A为0．27;20 e时，G为533，A为0．27。t为每升加入的克数。

凝胶层析又称排阻层析、凝胶过滤、渗透层析或分子筛层析等。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外(所用洗脱液的体积为外水体积);而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走(所用洗脱液的体积为内水体积)。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。

用作凝胶的载体物质有交联葡聚糖、聚丙烯酰胺和琼脂糖等。使用最多的是交联葡聚糖。交联葡聚糖的商品名为Sephadex，是由链状葡聚糖通过交联剂1-氯代-2，3-环氧丙烷交联而成。交联剂添加越多，孔径越小，吸水量也越小;反之越大。以G-x表示型号，后面的数字可以看出交联度，数字越小，交联度越大。SephadexG-25的吸水量为2．5 ml/g，干粒子直径100～300μm，筛孔40～60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子从内水体积流出。

【实验器材】

紫外分光光度计、石英比色皿、内径1．2 cm、高30 cm的玻璃层析柱、乳胶管和止水夹、试管20支、玻璃棒、试管架等。

【药品试剂】

饱和硫酸铵溶液、固体硫酸铵、葡聚糖凝胶SephadexG-25等。

【实验方法】

1．蔗糖酶盐析:

(1)乙醇沉淀后的蔗糖酶的溶解。将经过热变性和乙醇沉淀后的固体蔗糖酶(保存在－20℃)溶解在20 ml蒸馏水中，4℃条件下，10000 r/min离心10分钟，上清液(供试原粗酶液)用量筒量体积，冰上备用。留取1 ml上清液用于蛋白质含量测定和酶活力测定。

(2)第一次硫酸铵沉淀:25℃条件下，30%硫酸铵沉淀杂蛋白。将上述蔗糖酶粗酶提取液放置到25℃水浴锅中保温，然后根据硫酸铵溶液饱和度计算表(见附录)和测量得到的蔗糖酶溶液体积计算加入固体硫酸铵的克数，使得此时蔗糖酶粗酶提取液中硫酸铵的饱和度为30%。在25℃条件下边搅拌边加入固体硫酸铵，直至硫酸铵完全溶解，25℃条件下，10000 r/min离心10分钟分离沉淀物，上清液用量筒量体积，保存备用。留出1 ml30%硫酸铵沉淀后的上清液，测定蛋白质含量和酶活力。沉淀也用适量蒸馏水溶解后备用，测定蛋白质含量和酶活力。此时蔗糖酶基本上是在上清液中。

(3)第二次硫酸铵沉淀:25℃条件下，70%硫酸铵沉淀蔗糖酶。将上述蔗糖酶粗酶提取液放置到25℃水浴锅中保温，然后根据硫酸铵溶液饱和度计算表(见附录)和测量得到的蔗糖酶溶液体积计算加入固体硫酸铵的克数，使得此时蔗糖酶粗酶提取液中硫酸铵的饱和度为70%。在25℃条件下边搅拌边加入固体硫酸铵，直至硫酸铵完全溶解，25℃条件下，10000 r/min离心10分钟分离沉淀物，上清液保存备用，并测定蛋白质含量和酶活力。根据沉淀多少用适量体积蒸馏水溶解，此时蔗糖酶大多在沉淀物中。

一般情况下并不知道所要分离的蛋白质在硫酸铵中的溶解度，需要进行预实验分析。具体步骤为:取一定体积待分离的粗酶液，在0℃或25℃的温度下，边搅拌边加入固体硫酸铵至一定的浓度，冷冻离心分离沉淀物，记录上清液体积。根据沉淀物溶解液中酶活参数测定结果，调整试验方案，向所分离的上清液补加硫酸铵至一定浓度，直至获得较理想的酶分级分离提取效果。记录调整盐析浓度时，所添加的硫酸铵的数量。

2．测定上述成分中的酶活力和蛋白质含量，具体方法参照前面实验二。填写表4-10。根据实验结果，选出较好的分级沉淀蔗糖酶的实验方案，或提出进一步改进分级沉淀提取蔗糖酶的实验方案。

表4-10　　　　　　　硫酸铵沉淀纯化表

3．SDS-PAGE电泳分析盐析后蛋白质的纯度。具体方法参照蛋白质实验部分。

4．葡聚糖凝胶柱脱盐:盐析分级沉淀得到的蔗糖酶溶液含有大量的硫酸铵，铵盐的存在对蔗糖酶的进一步分离纯化有影响，因此必须除去。当蔗糖酶液流经凝胶柱时，酶被排阻在凝胶外面先流出来，而小分子量的盐类则扩散到凝胶网孔内部后，经较长路径再流出，由于大小分子向下运动的速度不同，最终将盐和大分子的酶分离。这种方法脱盐的速度不仅比透析法脱盐快，而且大分子物质不变性。

(1)装柱:将一定体积的洗脱液加入已溶胀的凝胶中，混匀。尽量沿柱壁一次徐徐灌入柱中，以免出现不均匀的凝胶带。凝胶浆过稀易出现不均匀的裂纹;过于粘稠，会吸留气泡。

新装的柱用适当的缓冲液平衡后，将带色的蓝色葡聚糖－2000配成2 mg/ml的溶液过柱，观察色带是否均匀下降。均匀下降说明柱层床无裂纹或气泡，否则必须重装。

(2)打开柱的上盖，让缓冲液流出，直至液面与凝胶床面相平。将一定量的酶液(上述盐析后蔗糖酶活性最高的溶液)小心加到凝胶床的表面。待样品恰好通过层床后，用少量洗脱液冲洗凝胶表面，待少量洗脱液流进层床后，补加缓冲液至合适的高度，旋紧柱上盖，开启恒流泵，以一定量的洗脱缓冲液按0．5～1．0 ml/min速度洗脱，每3～5 ml收集一管。

(3)在280 nm波长下，测定各收集管中溶液的蛋白质含量及脱盐情况。

5．将脱盐后的蔗糖酶溶液中加入等体积的乙醇，具体方法同前面蔗糖酶的粗酶提取方法。将沉淀后的蔗糖酶在－20℃保存。

【注意事项】

1．比活力指样品中单位蛋白质(mg蛋白质或mg蛋白氮)所含的酶活力单位。

2．提纯倍数指提纯后酶液的比活力与粗酶液的比活力之比值。3．提取率指提纯后酶液的总活力与粗酶液酶的总活力之比。4．总活力=酶活力(U/ml)×酶液总体积

5．用硫酸铵分级沉淀提取蔗糖酶时，酶液体积指的是离心分离所得沉淀提取物溶解后的总体积。

【思考题】

1．常用的蛋白质脱盐方法有哪些?

2．蛋白质的沉淀还有哪些方法?

3．柱层析有哪些种类，原理各是什么?