纤维素柱层析纯化蔗糖酶

实验九　DEAE纤维素柱层析纯化蔗糖酶

【实验目的】

1．掌握DEAE纤维素柱层析的原理和方法。

2．利用DEAE纤维素柱层析方法纯化蔗糖酶。

【实验原理】

离子交换层析是常用的层析方法之一。该方法是以离子交换剂为固定相，液体为流动相。离子交换剂与水溶液中离子或者离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或者离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。在某一pH值条件下，不同蛋白质带有不同的电荷，因而与离子交换剂的亲和力不同。当洗脱液的pH值改变或者是盐离子强度逐渐提高时，使得某一种蛋白质的电荷被中和，从而与离子交换剂的亲和力下降，不同蛋白质按照带有电荷的强弱逐渐被洗脱下来，从而达到了分离的目的。

离子交换剂由基质、电荷基团(功能基团)和反离子构成。根据离子交换剂中反离子的电荷性质可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。在阳离子交换剂中反离子带有正电荷，与溶液中带有正电荷的离子或者离子化合物进行可逆交换;阴离子交换剂中反离子带有负电荷，与溶液中带有负电荷的离子或者离子化合物进行可逆交换。

当溶液pH大于蛋白质等电点时，该蛋白质带负电荷;相反，当溶液pH值小于该蛋白质的等电点时，该蛋白质带有正电荷。

【实验材料】

蔗糖酶粗分离纯化样品。

【实验器材】

高速冷冻离心机、紫外分光光度计、恒温水浴锅、石英比色皿、玻璃层析柱(内径1．2 cm、高30 cm)、乳胶管和止水夹、试管20支、玻璃棒、试管架等。

【药品试剂】

1．DEAE-Sepharose Fast Flow(弱碱性阴离子交换剂)。

2．20 mmol/L Tris-HCl，pH7．3缓冲液。

3．20 mmol/L Tris-HCl，pH7．3，1 mol/L NaCl缓冲液。

4．0．2 mol/L乙酸缓冲液，pH4．5。

【实验方法】

1．离子交换剂的准备:称取1．5 g DEAE-Sephadex23(DE-23)干粉，加入0．5 mol/L NaOH溶液，轻轻搅拌，浸没0．5小时，用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至中性，抽干后放入小烧杯中，加入50 ml 0．5 mol/L HCl，搅拌均匀，浸泡0．5小时。同上面的处理，用去离子水洗至中性。将DE-23浸入20 mmol/L Tris-HCl(pH7．3)缓冲液中平衡备用。

2．样品处理:将乙醇沉淀后的蔗糖酶蛋白样品充分溶解在15 ml 20 mmol/L Tris-HCl pH 7．3缓冲液中(样品Ⅰ)，4℃条件下，15000 r/min，离心10分钟，收集上清液并测定总体积。留出1 ml用于蔗糖酶蛋白质含量测定、酶活力测定和SDS-PAGE分析。将其余的样品用于离子交换柱层析进一步分离纯化蔗糖酶。

3．装柱与平衡:先将层析柱垂直装好，在烧杯内用20 mmol/L Tris-HCl pH7．3缓冲液洗DE-23几次，然后轻轻搅匀，注意此时DE-23纤维素不能太稀，也不能太稠，应刚好呈现流质状态。将纤维素用玻璃棒引流慢慢连续加入层析柱内。注意在装柱过程中不能在柱内产生气泡。待凝胶自然沉积1～2 cm后松开层析柱下端的止水夹，调节流速为0．8～1 ml/min;待层析柱内的DE-23沉降至稳定高度并距离层析柱上端约3 cm处，用20 mmol/L Tris-HCl pH7．3缓冲液进行柱平衡，直至流出液与缓冲液的pH一致。

4．上样:待20 mmol/L Tris-HCl pH7．3缓冲液液面与层析柱中基质表面相切时，关闭止水夹，用胶头滴管缓慢将蔗糖酶蛋白样品加到层析柱上面，注意加样时液体应顺着层析柱内壁滴加，避免破坏层析柱胶体表面的平整。打开止水夹，使样品进入基质，样品完全进入基质后，开始用洗脱缓冲液洗脱蛋白质样品。

5．梯度洗脱:加样后，用20 mmol/L Tris-HCl pH7．3缓冲液进行平衡，此时的洗脱速度控制在0．8～1 ml/min，洗去未被DE-23吸附的杂蛋白，直至层析柱流出液在紫外分光光度计上测出的基线稳定(A₂₈₀=0或者接近0)。用20 mmol/L Tris-HCl pH7．3缓冲液NaCl梯度洗脱(浓度为0.1 mol/L NaCl)，层析柱连上梯度混合器，混合区中分别为50 ml 20 mmol/L Tris-HCl pH7．3缓冲液和50 ml含有1 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl pH7．3缓冲液。每4 ml流出液收集为一管，洗脱至缓冲液流完。

6．测定各收集管中样品的酶活力和蛋白质含量。

7．SDS-PAGE分析各管样品中蛋白质的纯度。

8．将蔗糖酶含量高、酶活性高并且纯度高的几管样品混合(样品Ⅱ，测定蛋白质含量和酶活性)，测量体积，用乙醇沉淀后在－20℃保存。

9．根据实验结果，填写表4-11。

表4-11　　　　　　　DEAE纯化表

【思考题】

1．简述DEAE柱层析的原理。

2．利用离子交换层析分离蛋白质有哪些注意事项?