底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数

实验十　底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数K_m

酶的动力学性质分析是酶学研究的重要方面。测定K_m和V_max，特别是测定K_m，是酶学研究的基本内容之一，K_m是酶的一个基本特性常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质，特别是同一种酶能够作用于几种不同的底物时，米氏常数K_m往往可以反映出酶与各种底物的亲和力强弱，K_m值越大，说明酶与底物的亲和力越弱;反之，K_m值越小，酶与底物的亲和力越强。

【实验目的】

1．掌握米氏常数的含义。

2．掌握双倒数作图法的原理和操作方法。

【实验原理】

1913年，Michaelis和Menten首先提出了酶促反应中反应速度和底物浓度的关系式。即米氏方程式:

式中:V₀为反应初速度;V为最大反应速度;［S］为底物浓度;K_m为米氏常数，其单位为摩尔浓度。K_m值是酶的一个特征性常数，一般说来，K_m可以近似地表示酶与底物的亲和力。测定K_m值是酶学研究中的一个重要方法。

Lineweaver-Burk作图法是用实验方法测定K_m值的最常用的比较方便的方法。

Lineweaver和Burk将米氏方程改写成倒数形式:

实验时选择不同的［S］，测定相对应的V。求出两者的倒数，以1/V对1/［S］作图，则得到一斜率为“K_m/V”的直线(图4-2)。将直线外推与横轴相交，其横轴截距为－1/［S］=1/V由此求出K_m值。

图4-2双倒数作图法

双倒数作图法应用最广泛，其优点是:①可以精确地测定K_m和V_max;②根据是否偏离线性可以很容易看出反应是否违反Michaelis-Menten动力学;③可以较为容易地分析各种抑制剂的影响。此法的缺点是实验点不均匀，反应速度小的时候误差很大。

【实验材料】

纯化后的蔗糖酶。

【实验器材】

分光光度计、水浴锅、试管等。

【药品试剂】

同实验二中蔗糖酶活力测定所需试剂。

【实验方法】

1．葡萄糖标准曲线的制备:具体步骤同实验二蔗糖酶活力的测定和比活力的分析。

2．酶活力预试:按照表4-12进行操作。将纯化后的蔗糖酶进行不同倍数的稀释，然后测定稀释后蔗糖酶的活力，选择最后测得的吸收值在1左右的酶作为测定蔗糖酶K_m值的样品。在测定K_m值时，蔗糖酶活力过高或者是过低都不利于K_m的测定。

表4-12　　　　　　　蔗糖酶活力预试实验

3．底物浓度对酶反应速度的影响:准备14支试管按照表4-13进行实验，其中7支试管分别作为另外7支试管的对照。对照中的反应物与反应管中的相同，只是加入的顺序不同，对照管中的酶在二硝基水杨酸和NaOH的后面加入，其余反应步骤也相同。

表4-13　　　　　　底物浓度对酶反应速度的影响

4．计算:根据上述实验结果填写表4-14中相应的数据并计算蔗糖酶的K_m值。表中V代表生成产物葡萄糖的速率，即5分钟单位时间内1 ml蔗糖酶反应生成的葡萄糖的量;［S］=300·V/2，300代表蔗糖的浓度为300 mmol/L;［S］代表底物蔗糖的摩尔浓度(mmol/L);V代表每支试管中加入的底物蔗糖的体积;2指的是反应的总体积是2 ml。

表4-14　　　　　　　数据处理和结果计算

【思考题】

1．简述K_m值的含义及测定的方法。

2．测定K_m值的方法有哪些，各有什么优缺点?