纸层析法定性检测氨基移换反应

实验四　纸层析法定性检测氨基移换反应

【实验目的】

1．学习一种鉴定氨基移换作用的简便方法及其原理。

2．进一步掌握纸层析的原理和操作技术。

3．了解氨基移换作用在物质代谢中的意义。

【实验原理】

氨基酸分子上的α-氨基转移到α-酮酸分子上的反应过程称为转氨基作用(或称氨基移换作用)。转氨基作用是氨基酸代谢的重要反应之一，该反应由转氨酶所催化。经转氨后，原来的α-氨基酸变成了相应的α-酮酸，原来的α-酮酸则成为新的、相应的α-氨基酸。

测定转氨酶活性的方法很多，如分光光度法、纸上层析法及光电比色法等。本实验利用纸上层析法，检查由谷氨酸和丙酮酸在谷丙转氨酶的作用下所生成的丙氨酸，证明组织内氨基移换作用。

氨基酸的纸上层析属于分配层析。以滤纸及其结合水作为固定相，把欲分离的混合氨基酸样品加于滤纸上，使流动相(展开剂)经此移动，样品中各组分就在两相溶剂间发生分配现象，在固定相中分配比例较大的氨基酸，随流动相移动的速度就慢;在流动相中分配比例较大的氨基酸，随流动相移动的速度就快。由于各种氨基酸的分配系数不同，就逐渐集中于滤纸上不同的部位，而彼此分离。层析完毕后，可用茚三酮乙醇液喷洒滤纸，使氨基酸显色形成斑点。

各种氨基酸都有其特征的R_f值，因此可根据R_f值来鉴定被分离的氨基酸。氨基酸组分的比移值(R_f)表示如下:

【实验材料】

家兔。

【实验器材】

培养皿、表面皿、滤纸、匀浆器、试管、试管架、恒温水浴锅、毛细管、移液管、喷雾器、剪刀、铅笔、格尺。

【药品试剂】

1．0．01 mol/L pH7．4磷酸缓冲液:0．2 mol/L Na₂HPO₄溶液81 ml，0．2 mol/L NaH₂PO₄溶液19 ml混匀，蒸馏水稀释20倍。

2．0．1 mol/L丙氨酸溶液:称取丙氨酸0．891 g先溶于少量0．01 mol/L pH7．4磷酸缓冲液中，以1 mol/L NaOH仔细调节至pH7．4后，用磷酸盐缓冲液加至100 ml。

3．0．01 mol/Lα-酮戊二酸溶液:称取α-酮戊二酸1．461 g，先溶于少量0．01 mol/L pH7．4磷酸缓冲液中，用1 mol/L NaOH仔细调节至pH7．4后，用磷酸盐缓冲液加至100 ml。

4．0．1 mol/L谷氨酸溶液:称取谷氨酸0．735 g先溶于少量0．01 mol/L pH7．4磷酸缓冲液中，以1 mol/L NaOH仔细调节至pH7．4后，用磷酸缓冲液加至100 ml。

5．0．2%茚三酮溶液:称取茚三酮0．2 g溶于100 ml 95%乙醇中。

6．层析溶剂:水饱和的苯酚。

【实验方法】

1．酶液的制备:将兔击晕，迅速解剖，取出肝脏，在低温条件下剪碎。用表面皿称取1．5 g肝脏，放入匀浆器中，加入3 ml磷酸缓冲液。研成匀浆后，倒入离心管中，在2500 r/min的条件下，离心5分钟，取上清液，即为制备的酶液。

2．体外氨基移换反应:取干燥大试管二支，分别标明测定管与对照管，按表5-6进行操作:

表5-6　　　　　　　体外氨基转移反应

取出冷却后，分别用滤纸过滤或2000 r/min离心3～5分钟，滤液或上清液分别收集到新的干燥小试管中以备点样。

3．纸层析:取10 cm×15 cm层析滤纸1张，用铅笔在距层析滤纸一端2 cm画一条横线，并在横线上标示4个样品的点样位置，分别标定“测定”、“对照”、“谷氨酸”、“丙氨酸”。然后用4根毛细管分别将对照管、测定管、标准谷氨酸溶液和标准丙氨酸溶液点在层析滤纸的横线上。点样时，将毛细管口轻轻触到滤纸上，使每种溶液分别形成直径为2～3mm的圆斑，两点间隔约2 cm。为了有足够量样品点在滤纸上，每种溶液应重复点3～4次。待自然风干(或用吹风机吹干)，再点下一样品。点样量应力求均匀相等。

在洁净干燥的小培养皿中，加入约20 ml酚溶剂(展开剂)。将小培养皿放在层析缸底部，加盖密闭，保持10分钟，使缸中展开剂蒸气达到饱和。将滤纸点样端朝下悬挂于层析缸盖中心的挂钩上，放入层析缸，使点样端浸入展开剂中约0．5 cm，不要使点样点直接与溶剂接触，加盖密闭，进行层析。待展开剂上升至滤纸上端2 cm处时(约需1小时)，取出滤纸，用铅笔画出溶剂前沿，室温干燥或吹干。

4．显色:用玻璃喷雾器向滤纸均匀喷洒0．1%茚三酮无水乙醇溶液，置60～80℃烤箱中烘烤5分钟，即显现被染成紫红色的氨基酸斑点。

5．实验结果:用铅笔画出条带的边框，测出表5-7中的数值，计算R_f值。与已知的标准的氨基酸R_f进行对比，指出条带所对应的氨基酸，并根据结果解释转氨作用。

表5-7　　　　　　　层析实验中R_f值的测定

【注意事项】

1．层析滤纸不可用手触摸，以免有手印。

2．在滤纸上画线时只能用铅笔，不可用其他笔。

3．点样时毛细管不能交叉污染。

【思考题】

1．如果对照管在沸水中煮的时间不够充分，会在层析结果中出现什么现象?

2．氨基酸纸上色谱鉴定法操作的关键是什么?