实验八 脂肪酸的β-氧化
——酮体测定法
【实验目的】
1．了解脂肪酸的β-氧化作用。
2．掌握测定β-氧化作用的方法及其原理。
【实验原理】
在肝脏中，脂肪酸经β-氧化作用生成乙酰CoA。生成的乙酰CoA可经代谢缩合成乙酰乙酸，而乙酰乙酸既可脱羧生成丙酮，也可经β-羟丁酸脱氢酶作用被还原生成β-羟丁酸。乙酰乙酸、β-羟丁酸和丙酮三种物质统称酮体。酮体为机体代谢的正常中间产物，在肝脏中生成后须被运往肝外组织才能被机体所利用。在正常情况下，动物体内含量甚微;患糖尿病或食用高脂肪膳食时，血中酮体含量增高，尿中也能出现酮体。
本实验用丁酸做底物，将之与新鲜的肝匀浆一起保温后，再测定其中酮体的生成量。
因为在碱性溶液中碘可以将丙酮氧化为碘仿(CHI3)，所以通过用硫代硫酸钠(Na2S2O3)滴定反应中剩余的碘就可以计算出所消耗的碘量，进而可以求出以丙酮为代表的酮体含量。有关的反应式如下:
CH3COCH3+4NaOH+3I→─
2CHI3+CH3COONa+3NaI+3H2O I2+2Na2S2O3←→Na2S4O6+2NaI
根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠溶液体积之差，就可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。
【实验器材】
匀浆器或研钵、剪刀、镊子、漏斗、锥形瓶(50ml)、试管、刻度吸管(5ml、10ml)、微量滴定管(5ml)、恒温水浴锅、碘量瓶、电子天平。
【药品试剂】
1．10%(W/V)氢氧化钠溶液:称取10 g氢氧化钠，在烧杯中用少量蒸馏水将之溶解后，定容至100ml。
2．0．1 mol/L碘溶液:称取12．7 g碘和约25 g碘化钾，放置于研钵中。加入少量蒸馏水后，将之研磨至溶解。用蒸馏水定容到1000ml，在棕色瓶中保存。此时可用标准硫代硫酸钠溶液标定其浓度。
3．0．5 mol/L正丁酸:取5ml正丁酸，用0．5 mol/L氢氧化钠溶液中和至pH7．6，并用蒸馏水稀释至100ml。
4．0．1 mol/L碘酸钾(KIO3)溶液:称取0．8918 g干燥的碘酸钾，用少量蒸馏水将之溶解，最后定容至250ml。
5．0．1 mol/L硫代硫酸钠(Na2S2O3)溶液:称取25 g硫代硫酸钠，将它溶解于适量煮沸的蒸馏水中，并继续煮沸5分钟。冷却后，用冷却的已煮沸过的蒸馏水定容到1000ml。此时即可用0．1 mol/L碘酸钾溶液标定其浓度。
硫代硫酸钠溶液的标定:将蒸馏水25ml、碘化钾2 g、碳酸氢钠0．5 g、10%盐酸溶液20 ml加入一支锥形瓶内。另取0.1 mol/L碘酸钾溶液25ml加入其中，然后用硫代硫酸钠溶液将之滴定至浅黄色。再加入0．1%淀粉溶液2 ml，然后继续用硫代硫酸钠溶液将之滴定至蓝色消褪为止。另设空白对照，其中仅以蒸馏水代替碘酸钾，其余操作相同。计算硫代硫酸钠溶液的浓度所依据的反应式如下:
5KI+KIO3═══+6HCI 3I2+6KCI+3H2O
I2+2Na2S2O═══3Na2S4O6+2NaI
6．标准0．01 mol/L硫代硫酸钠溶液:临用时将已标定的0．1 mol/L硫代硫酸钠溶液稀释成0．01 mol/L。
7．10%(V/V)盐酸溶液:取10 ml盐酸，用蒸馏水稀释到100 ml。
8．0．1%(W/V)淀粉溶液:称取0．1 g可溶性淀粉，置于研钵中。加入少量预冷的蒸馏水，将淀粉调成糊状。再慢慢倒入煮沸的蒸馏水90 ml，搅匀后，再用蒸馏水定容到100 ml。
9．0．9%(W/V)氯化钠。
10．磷酸缓冲液(pH7．7):取下列A液90 ml和B液10 ml，将两者混合即可。
A液Na2HPO4溶液:称取1．187 g Na2HPO4·2H2O，将之溶解于蒸馏水中，定容到100 ml。
B液KH2PO4溶液:称取0．9078 g KH2PO4，将之溶解于蒸馏水中，最后定容至100 ml。
11．15%三氯乙酸溶液。
【实验方法】
1．肝糜的制备:将动物(如鸡、家兔、大鼠或豚鼠等)处死，迅速放血，取出肝脏。用0．9%氯化钠溶液洗去肝脏上的污血，然后用滤纸吸去表面的水分。称取肝组织5 g置于研钵中，加少量0．9%氯化钠溶液，研磨成细浆，再加0．9%氯化钠溶液至总体积溶液至总体积为10 ml。
2．保温和沉淀蛋白质:
(1)取两个50 ml锥形瓶，编号，按表5-10操作。
表5-10 肝糜的处理
(2)将加好试剂的2个锥形瓶摇匀，放入43℃恒温水浴锅中保温40分钟后取出。
(3)于2个锥形瓶分别加入15%三氯乙酸溶液3 ml，摇匀后，于室温放置10分钟。
(4)将锥形瓶中的混合液转移到离心管，4000 r/min离心10分钟收集无蛋白质上清液于事先编号A、B的试管中。
3．酮体的测定
(1)取碘量瓶2个，根据上述编号顺序按表5-11操作。
表5-11 酮体的测定
(2)加完试剂后摇匀，将碘量瓶于室温放置10分钟。
(3)每各碘量瓶中分别滴加10%盐酸溶液，使各瓶中溶液中和到中性或微酸性(可用pH试纸进行检测)。
(4)用0．01 mol/L硫代硫酸钠溶液滴定到碘量瓶中的溶液呈浅黄色时，往瓶中滴加数滴0．1%淀粉溶液，使瓶中溶液呈蓝色。
(5)继续用0．01 mol/L硫代硫酸钠溶液滴定到碘量瓶中溶液的蓝色消褪为止。
(6)记录下滴定时所用去的硫代硫酸钠溶液毫升数，计算样品中丙酮的生成量。
4．结果与计算:根据滴定样品与对照所消耗的硫代硫钠溶液体积之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。计算公式如下:
每克肝脏的丙酮含量(mmol/g)=(A－B)×C/(6×m)
式中:
A为滴定对照所消耗的0．01 mol/L Na2S2O3的毫升数;
B为滴定样品所消耗的0．01 mol/L Na2S2O3的毫升数;
C为标准Na2S2O3的浓度(0．01 mol/L);
m为所滴定的样品里含肝脏的质量(g)。
【注意事项】
1．肝匀浆必须新鲜，放置久则失去氧化脂肪酸能力。
2．碘量瓶作用是防止碘液挥发，不能用锥形瓶代替。
【思考题】
1．为什么说做好本实验的关键是制备新鲜的肝糜?
2．什么叫做酮体?为什么正常代谢时产生的酮体量很少?在什么情况下血中酮体含量增高，而尿中也能出现酮体?
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
