实验五 农杆菌介导的拟南芥转基因方法
【实验目的】
1.通过本实验使学生掌握农杆菌转化拟南芥的方法。
2.拟南芥转基因植株的筛选。
【实验原理】
目前，拟南芥植株稳定转化有5种基本方法:①农杆菌接种拟南芥的外植体组织，其中包括子叶、叶和根等;②农杆菌接种种子;③农杆菌注射到完整的植物枝条的分生组织;④完整的拟南芥植株用农杆菌的液体悬浮液作真空渗入;⑤花浸法。以上方法可根据研究目的和要求不同而选择。
目前广泛应用的转化方法是花浸法(floral dip)(Clough和Bent，1998)。其基本操作是将刚开花的拟南芥花序倒置于含有目的基因的农杆菌转化介质中，浸泡数十秒钟，以达到转化目的。也可直接用喷雾器将含有农杆菌的转化介质均匀喷洒到拟南芥的花上。
在转基因操作中，需要有一个筛选标记表明转基因植株和野生型植株之间的差异。使用最多的选择性标记基因是编码抗生素或除草剂的抗性基因。例如，编码抗生素抗性的基因有新霉素磷酸转移酶基因npt II(具有对卡那霉素、G418以及新霉素的抗性)、潮霉素磷酸转移酶基因hpt(具有对潮霉素抗性)和氨基糖苷腺苷酰基转移酶基因aadA(具有对链霉素抗性)。编码除草剂抗性的基因有膦丝菌素乙酰转移酶基因bar(具有对膦丝菌素和双丙氨膦的抗性)和突变型5-稀醇丙酮酰草酸-3-磷酸合酶基因EPSPS。
【实验材料】
使用材料为哥伦比亚野生型拟南芥。选取野生型拟南芥种子，种植于花盆内，放在4℃低温处理24小时(春化处理)，然后将花盆置于22～25℃光照下使其萌发生长，待植株生长到初果期(即花序基部的角果刚形成时)，选取健壮植株作为转基因材料。在转基因前，停止浇水，使盆钵中的蛭石干燥，以防止于将植株倒置时蛭石被倒出。
【实验器材】
1.恒温摇床和恒温培养箱:培养农杆菌。
2.超净工作台:接种。
3.高压灭菌锅:培养基灭菌。
4.500ml烧杯:转化植株。
5.离心机和离心管:收集农杆菌。
6.锥形瓶等用具。
【药品试剂】
1.LB培养基。
2.含有双元载体的农杆菌GV1301悬浮液(对数生长期):将目的基因构建到双元载体上，之后将重组的双元载体转入农杆菌GV1301并用卡那霉素筛选含有重组双元载体的菌落。将农杆菌接种在LB液体培养基(含有25mg/L庆大霉素用于筛选Ti质粒，50mg/L卡那霉素用于筛选T-DNA)中，28℃，180r/min条件下振荡培养至对数生长期，在4℃和－20℃分别保存菌株备用。
3.侵染液: 1/2MS培养基中加入1×B5维生素和5%蔗糖，混匀后加入终浓度为50μl/100ml Silwet L-77试剂，在使用前加入6-苄氨基嘌呤(benzylamino purine，10μl/L of 1mg/ml stock in DMSO)，使其在溶液中的终浓度为0.044μmol/L。或者使用含有50μl/100ml Silwet L-77的5%蔗糖水溶液作为侵染液。
4.1/2 MS固体培养基(参见实验三十三植物培养基的配制)。5.50mg/ml卡那霉素。
【实验方法】
一、农杆菌感受态细胞的制备
1.将农杆菌GV3101接种在含有25mg/L庆大霉素的LB固体培养基上，26～28℃培养48小时。
2.挑取单菌落接种到40ml LB液体培养基中，28℃条件下，250r/min悬浮培养12～20小时。
3.在超净工作台上将菌液转入无菌的50m l离心管中，4℃，5000r/min离心8分钟。
4.弃上清液，用100mmol/L NaCl(4℃预冷)重悬农杆菌，4℃，5000r/min离心8分钟。
5.弃上清液，加入原始农杆菌菌液1/50体积(800μl)的20mmol/L CaCl2溶液重悬菌体，并分装成100μl/管。
6.将分装后的离心管置于液氮中10秒，－80℃保存。
二、质粒转化农杆菌
1.将感受态农杆菌GV3101(100μl/管)置冰上，加入1μg质粒DNA(质粒体积不超过10μl)。充分混匀后在冰上放置30分钟。
2.置于液氮中1分钟。
3.迅速转入37℃水浴中，待其融化。
4.加入1m l LB液体培养基，28℃，250r/min，培养2～4小时。
5.将菌液均匀涂布到含有50mg/L卡那霉素和25mg/L庆大霉素的LB固体培养基上，在超净台上吹干。
6.28℃条件下，培养48小时。
7.挑取单菌落接种到含有卡那霉素和庆大霉素的液体LB培养基中，28℃条件下，250r/min离心，培养48小时后的菌液用于保存和植株转化。
三、利用花浸法转化拟南芥
1.在转化前三天，接种含有双元载体的农杆菌到5ml含有抗生素(25mg/L庆大霉素和50mg/L卡那霉素)的LB液体培养基中，28℃下振荡培养2天。
2.两天后，将1ml培养的农杆菌转移到100ml含有抗生素的LB液体培养基中，28℃继续振荡培养约24小时，此时OD600为1.2～1.8。
3.将农杆菌转入离心管中，6000r/min，室温条件下，离心10分钟，然后将上清液倒出，留沉淀备用。
4.将沉淀用400ml浸染液重悬，形成均匀的农杆菌悬浮液，并将农杆菌悬浮液转移到一个敞口的器皿中(500ml烧杯)。
5.选取初果期的健壮植株，带盆钵一起倒扣于盛有农杆菌悬浮液的容器上方，将整个花序浸入上述农杆菌悬浮液中约30秒，注意叶片尽量不与浸染液接触，同时确保所有的花都浸在农杆菌培养液中，莲座叶与培养液之间距离2cm。同一个烧杯中的农杆菌悬浮液可以转化10株或者更多株拟南芥。在此过程中，尽量避免将蛭石倒入农杆菌悬浮液中。
6.将盆钵取下，横放于暗箱中约24小时。
7.24小时后将处理过的拟南芥植株放于22～25℃的光照条件下正常生长。
8.生长约4周时角果变黄，用纸袋将植株套住，侧放。再过1周后剪下植株，收种子，在恒温培养箱中干燥1周后于4℃保存。
9.转基因种子的筛选。将收获的转基因拟南芥种子(T0代种子，其中有的是转基因成功的，有的是没有转基因的。对于二倍体的拟南芥，此时转基因成功的种子是杂合体)置于70%乙醇中1分钟，50%安替福明溶液中5分钟，无菌水洗5次，每次2分钟，然后将消毒好的种子在超净工作台中均匀撒播在含卡那霉素50mg/ L的1/2MS固体培养基中，将培养皿封口置于4℃冰箱中春化2～3天，之后置于22～25℃光照培养箱中生长。观察植株生长状况，初步筛选转化体。在含卡那霉素50mg/L的培养基上约3～4天种子萌发，5～7天后观察到转化植株开始呈现绿色，约两周后，转化植株整株呈现绿色，植株健壮，初步鉴定为转基因植株(T1代)。同时，未转化植株则逐渐黄化(或白化)死亡。将筛选得到的转基因植株转移到蛭石中继续生长，并单株收取种子(T1代种子)。
【注意事项】
1.拟南芥转基因植株的准备。选取饱满的拟南芥种子，种在花盆中，置于短日照(光照10小时以下)温室中培养3周后转放到长日照条件下(光照12小时以上)诱导抽苔开花。开花时用剪刀切去莲座叶以上主花轴(此时植株高约10cm)，以促进次生花轴抽苔。剪切后7～9天用作转化实验材料，此时植株高10～15cm，最大花序已产生第1个角果，转化实验前一天停止浇水。
2.如果T-DNA为单一位点插入，此时的T1代种子中有纯合体也有杂合体，还有没有转化的种子，分离比为1∶2∶1。将T1代种子在含50mg/L卡那霉素的培养基上筛选，得到T2代的植株，此时的植株有纯合体也有杂合体。T2代植株结种子后，单株收获种子(T2代种子)。如果是纯合体(T2代)的种子，则在含50mg/L卡那霉素的培养基上筛选T2代种子时，种子均具有卡那霉素抗性，即萌发的小苗均为绿苗;如果是杂合体(T2代)的种子，则在含50mg/L卡那霉素的培养基上筛选T2代种子时，种子出现分离比，即绿苗∶黄化苗=3∶1。
【思考题】
1.拟南芥稳定转化有哪5种基本方法，试分析不同转化方法的优缺点。
2.阐述植物转基因技术的应用。
3.拟南芥作为研究植物发育的重要模式植株之一，有哪些特性?
4.为了提高转基因的效率，需要注意哪些事项?
5.在拟南芥转基因研究中，如何获得T-DNA插入的纯合体?
6.在转基因研究中，为什么有时候要强调一定要获得纯合体?
附:聚乙二醇介导的拟南芥原生质体转化方法
向植物原生质体瞬时导入外源大分子可以更快地对被导入材料的生物学活性进行分析。瞬时检测手段具有易操作性，可以用于鉴定启动子区的顺式作用调节序列，比较不同启动子间的转录强度以及研究环境因子对基因表达的影响，此外，用聚乙二醇介导的原生质体转化方法可以研究蛋白质在植物细胞内部的相互作用。
将DNA转入植物细胞的方法有很多。其中聚乙二醇(PEG)介导的转化常常用于建立稳定转化和基因的瞬时表达研究。PEG介导的转化具有一些优点:首先，达到最大的基因瞬时表达条件时，被转化细胞的存活率和细胞分裂速率很高;其次PEG介导的转化所用的材料和仪器较常规和便宜;最后，进一步的研究证明这种简单可靠的方法广泛适用于各种可制备原生质体的植物和组织。
植物组织取材和原生质体的制备方法可能会影响转化过程。在分离原生质体的操作中，利用较为温和的条件进行较长时间的细胞壁消化，会提高转化效率。热激处理可以增加某些系统的瞬时表达水平。但是在另外一些系统中却降低表达水平。可以分别采取简短的热激处理和不用热激处理进行转化实验。
调节PEG溶液中的二价阳离子可以获得不同的转化效率。用Ca2+代替Mg2+可以产生更高的瞬时表达水平，二价离子的浓度在5～15mmol/L范围可以使细胞的存活与DNA的吸收达到很好的平衡。
不同PEG浓度和处理时间以及PEG来源和分子量是影响转化效率的重要因素。对于较脆弱的原生质体的制备应用分子量高达4000U甚至高达8000U的PEG更为合适。
拟南芥叶肉细胞原生质体的提取和转化
主要根据Sheen(2001)的方法，略加修改。
1.取生长在温室中3～4周拟南芥的叶片，将其剪成0.5～1mm的叶条，用于原生质体的提取，作为PEG诱导转基因的实验材料。
2.将这些细条放入三角瓶中，加入10ml酶解液，抽真空20～40分钟。以22℃，每分钟60次转速酶解3小时。
3.用35～75目的筛子过滤酶解液，并倒入离心管中。100g离心，将原生质体沉入管底，弃上清液。
4.轻微振荡使沉淀悬浮，加入预冷的W5溶液清洗原生质体，100g离心2分钟，弃上清液。
5.再次轻微振荡使沉淀悬浮，加入预冷的MMg溶液清洗原生质体，100g离心2分钟，弃上清液，保留适量的体积进行PEG转化。
6.取10μl已成功构建的GFP融合基因的DNA(10～20μg)于离心管中，加入100μl含有原生质体的溶液，混匀之后再加入110μl PEG溶液，混匀，置23℃温育30分钟进行转化。
7.转化后，加入0.44mlW5溶液，100g离心2分钟，以去除PEG。
8.重新微振荡并悬浮沉淀，取100μl沉淀加入W5至总体积为1ml，将溶液放入细胞培养板中，室温培养12～16小时。
9.用激光共聚焦显微镜观察转化及表达情况。
溶液配制
1.酶解液: 1.5%(w/v)纤维素酶R10，0.4%(w/v)离析酶R10，0.4mol/L甘露醇，20mmol/L KCl，20mmol/LMES(pH5.7)，将上述溶液55℃加热10分钟，室温放置后，加入10mmol/L CaCl2，5mmol/Lβ-巯基乙醇，0.1%(w/v) BSA，然后用0.45μM滤膜过滤，避光4℃保存备用。
2.PEG溶液: 4g PEG4000，3mlddH2 O，2.5ml 0.8mol/L甘露醇，1ml 1mol/L CaCl2，4℃保存备用。
3.W5溶液: 154mmol/L NaCl，125mmol/L CaCl2，5mmol/L KCl，2mmol/L MES(pH5.7)。
4.MMg溶液: 0.4mol/L甘露醇，15mmol/L MgCl2，4mmol/L MES(pH5.7)。
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