方法验证外源基因转入植株

实验十七　PCR方法验证外源基因转入植株

【实验目的】

1.掌握利用PCR方法鉴定转基因植株的基本原理。

2.掌握植物基因组DNA提取的方法。

3.掌握采用PCR方法鉴定转基因植株。

【实验原理】

经过抗性筛选获得的转基因植株并非就是真正成功的转基因植株，抗性筛选过程中存在着一定的假阳性，还需要进一步的验证。其中利用PCR技术可以简单地初步验证植株是否为转基因植株。该方法涉及的实验技术简单，仅需要从转基因植株的叶片提取基因组DNA并进行PCR扩增。需要注意的是在PCR实验中需要根据载体的信息设计合适的引物。一般情况下，可以选择启动子和基因3'端的序列设计特异性引物，但是这种启动子必须不是植物所具有的，如35S启动子等。也可以选择35S启动子上的引物进行简单的鉴定。采用PCR方法进行转基因植株的验证时还必须注意需要有野生型植株作对照，即以野生型植株的基因组DNA为模板进行的PCR扩增。

【实验材料】

拟南芥转基因材料(如:转入pBI121空白质粒的植株)。

【实验器材】

PCR仪，高速离心机，电泳仪，核酸凝胶电泳槽，紫外凝胶成像系统等。

【药品试剂】

1.PCR相关试剂。

2.5'端引物: 35S启动子序列特异性引物(图2-1)。

3.基因组DNA提取相关试剂(见实验八)。

4.DNA电泳相关试剂。

图2-1　花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子的部分序列及鉴定引物

【实验方法】

植物基因组DNA的提取，参见实验十一。

1.按照表2-1将下列溶液加入PCR管中。

表2-1　PCR方法验证外源基因转入植株的反应体系

(以30μl反应体系为例)

反应条件: 94℃5分钟

　　　　　30循环(94℃/1分钟，55℃/1分钟，72℃/30秒);

　　　　　72℃延伸10分钟。

由图2-1中35S启动子上的引物进行鉴定时，合成的产物大小为123bp。

2.电泳并根据电泳的结果进行分析。

附:

1.当选择检测转基因植株中的nos终止子序列时，使用的引物序列如下。使用该引物扩增后的目的片段大小为118bp。

5'引物: 5'ccgcgcgcgataatttatcc 3'

3'引物: 5'gcatgacgttatttatgagatggg 3'

2.当选择将35S启动子5'端引物与nos终止子的3'端引物合用时，扩增的片段中包括了连入载体中的目的基因，参见载体图1-11。