任务1 杂交瘤细胞的制备
单克隆抗体制备的关键技术是骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选，以上综合就是杂交瘤细胞的制备。而单克隆抗体的生产包括动物免疫、饲养细胞、细胞融合、杂交瘤选择、抗体筛选、杂交瘤细胞的克隆化、冷冻保存以及单克隆抗体的大量制备等一系列实验步骤。
一、动物免疫
（一）动物的选择
作为免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。动物种类主要根据抗原的生物学特性和所要获得的抗血清数量来选择，要求动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾病，最好为雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。目前开展杂交瘤技术的实验室常用纯种BALB／C小鼠，因其较温顺，活动范围小，体弱，食量及排污量较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
（二）免疫方案
选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的单克隆抗体至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案并开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性而定。一要有质量好的抗原，二要选择适当的免疫途径，这样才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
（三）免疫途径
免疫途径多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1mL左右。途径的选择取决于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
（四）免疫佐剂
由于不同个体对同一抗原的反应不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
免疫佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T淋巴细胞与B淋巴细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和促进抗体的产生。
常用的免疫佐剂是弗氏佐剂，其成分通常是羊毛脂1份、石蜡油5份，羊毛脂与石蜡油的比例视需要可调整为1∶2～1∶9（体积比），这是弗氏不完全佐剂，在每毫升不完全佐剂中加入1～20mg卡介苗就成为弗氏完全佐剂。是否添加免疫佐剂视情况而定。
（1）颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原的免疫为例，初次免疫采用腹腔内注射，2～3周后同剂量第二次免疫，3周后静脉内注射同剂量加强免疫（融合前三天），然后取脾融合。
（2）可溶性抗原免疫原性弱，一般要加免疫佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状，表明已达到油包水的状态。商品化弗氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断更新，例如：
（1）将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量；
（2）改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射；
（3）使用细胞因子作为免疫佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原的反应性。
二、融合前的准备
（一）饲养细胞的制备
在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，例如，在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞和小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。
一般饲养细胞在融合前一天制备，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞，细胞浓度为5×106个／mL，小鼠脾细胞的浓度为1×106个／mL，小鼠的成纤维细胞（3T3）的浓度为1×105个／mL，用量均为每孔100μL。
（二）骨髓瘤细胞的培养
骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量单克隆抗体。常用骨髓瘤细胞系有NS1、SP2／0、X63-Ag 8.653等。
骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养基，如RPMI-1640、DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10%～20%，细胞的最大密度不得超过106个／mL，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5d传代一次。细胞的倍增时间为16～20h，悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。
一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6个月应用8-AG（8-氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，具有良好的形态，活细胞计数高于95%，也是细胞融合的关键。
（三）免疫脾细胞的制备
免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中的B淋巴母细胞和浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3d以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞占比较大，融合的成功率较高。
脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全培养液洗一次，置于培养皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常脾脏体积的2倍，细胞浓度为2×106个／mL左右。
三、细胞融合
（1）取对数生长期的骨髓瘤细胞，离心，弃上清液，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需数量的细胞，用不完全培养液洗涤。
（2）同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤。
（3）将骨髓瘤细胞与脾细胞按比例混合在一起，在塑料离心管内用不完全培养液洗涤。
（4）弃上清液，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。
（5）轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略微松动。
（6）在室温下融合。
四、杂交瘤选择（HAT法）
1.HAT法筛选杂交瘤细胞原理
HAT选择培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）而得到的培养液。细胞中的DNA合成有两条途径。一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT选择培养液中氨基喋呤是叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT选择培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的细胞的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽然“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右就会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。唯有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。
2.HAT选择方法
一般在细胞融合24h后，加入HAT选择培养液。在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。融合后最初补加的量可用全量的2／3，可得到满意的筛选结果。一般用HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，过3～4d后可改用一般培养液。
五、抗体筛选
在通过选择性培养而获得的杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。
检测抗体时应根据抗原的性质、类型的不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感为原则。
常用的方法如下。
（1）酶联免疫吸附试验（ELISA）：用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等单克隆抗体的检测。
（2）放射免疫分析法（RIA）：用于可溶性抗原、细胞单克隆抗体的检测。
（3）荧光激活细胞分类仪（FACS）：用于细胞表面抗原的单克隆抗体的检测。
（4）免疫荧光检测法（IFA）：用于细胞和病毒单克隆抗体的检测。
上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。必须在融合前建立可靠的筛选方法，避免由于方法不当而贻误整个筛选时机。
六、杂交瘤的克隆化和冷冻保存
杂交瘤的克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞，所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其他无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌细胞会被抗体非分泌细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞比抗体分泌细胞生长快，两者竞争的结果会使抗体分泌细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。
（一）杂交瘤的克隆化
杂交瘤的克隆化方法很多，最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。
1.有限稀释法
有限稀释法的操作步骤如下：
（1）制备饲养细胞悬液（同融合前准备）；
（2）进行阳性孔细胞的计数，并调节细胞数；
（3）取细胞，加入饲养细胞完全培养液；
（4）培养4～5d后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液；
（5）第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。
2.软琼脂平板法
软琼脂平板法的操作步骤如下：
（1）配制软琼脂；
（2）将上述琼脂液（含有饲养细胞）倾注于直径为9cm的培养皿中，在室温下凝固后作为基底层备用；
（3）按100个／mL、500个／mL或5000个／mL等浓度配制需克隆的细胞悬液；
（4）将1mL 0.5%琼脂液（预热至42℃）在室温下分别与1mL不同浓度的细胞悬液相混合；
（5）混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温下放置10min使其凝固，于37℃5% CO2培养箱中培养；
（6）4～5d后即可见针尖大小的白色克隆，7～10d后，直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养；
（7）检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。
（二）杂交瘤细胞的冷冻保存
及时冷冻保存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系时，在细胞的培养过程中随时可能出现细胞的污染、分泌抗体能力丧失等情况。如果没有原始细胞的冷冻保存，则可能因为上述意外而前功尽弃。
杂交瘤细胞的冷冻保存方法同其他细胞系的冷冻保存方法一样，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻成一支安瓿。
冷冻保存液最好预冷，操作动作应轻柔、迅速。冷冻保存时从室温可立即降到0℃，再降温时一般按每分钟降温2～3℃的速度降温，待降至-70℃时可放入液氮中。或将细胞管降至0℃后放入-70℃超低温冰箱中，次日转入液氮中。也可以用细胞冷冻保存装置进行冷冻保存。冷冻保存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。
七、单克隆抗体的鉴定
对制备的单克隆抗体进行系统的鉴定是十分必要的，应对其做以下方面的鉴定。
（一）抗体特异性的鉴定
除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其他抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA、间接血凝和免疫印迹技术等，同时还需做免疫阻断试验等。例如：①制备抗黑色素瘤细胞的单克隆抗体，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其他脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体；②制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白质有交叉反应，其次考虑与其他细胞因子间有无交叉反应。
（二）单克隆抗体的Ig类型与亚型的鉴定
购买兔抗小鼠Ig类型和亚型的标准抗血清，采用琼脂扩散法或ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型。一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG型或IgM型。至于亚型则需要用标准抗亚型血清系统做双扩或夹心ELISA来确定单克隆抗体的亚型。
（三）单克隆抗体的效价测定
单克隆抗体的效价可采用凝集反应、ELISA或放射免疫法测定。不同的测定方法测定的效价不同。采用凝集反应，腹水效价可达5×104，而采用ELISA检查，腹水效价可达1.0×106。培养上清液的效价远不如腹水的效价。单克隆抗体的效价以培养上清液和腹水的稀释度表示。
（四）单克隆抗体中和活性的鉴定
用动物的或细胞的保护试验来确定单克隆抗体的生物学活性。例如，如果要确定抗病毒单克隆抗体的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。
（五）单克隆抗体识别抗原表位的鉴定
用竞争结合试验测相加指数的方法，通过测定单克隆抗体所识别抗原位点，来确定单克隆抗体的识别的表位是否相同。
（六）单克隆抗体亲和力的鉴定
用ELISA或RIA竞争结合试验来确定单克隆抗体与相应抗原结合的亲和力。
八、影响因素和失败原因分析
由于制备单克隆抗体的实验周期长，环节多，所以影响因素比较多，稍不注意就会失败。主要的失败原因和影响因素如下。
（一）污染
污染包括细菌、真菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最棘手的问题。一旦发现有真菌污染，就应及早将污染板弃去，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其他添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，取出并分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。
（二）融合后杂交瘤不生长
在保证融合技术没有问题的前提下，主要考虑下列因素：
（1）PEG有毒性或作用时间过长；
（2）牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选；
（3）骨髓瘤细胞污染了支原体；
（4）HAT有问题，主要是A含量过高或H、T含量不足。
（三）杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体
（1）融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。
（2）有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。
（3）对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞受支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能是发生染色体丢失。
（4）防止抗体停止分泌的有效措施（“三要”、“三不要”）。
“三要”：要大量保持和补充液氮冷冻保存的细胞原管；要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况；要定期进行再克隆。
“三不要”：不要让细胞“过度生长”，否则不分泌抗体的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞；不要不加检查地任培养物连续培养几周或几个月；不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。
（四）杂交瘤细胞难以克隆化
可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞受支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液中加H、T。
知识拓展
1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B淋巴细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即单克隆抗体。Kohler和Milstein两人因此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。
抗体药物一般是由单克隆抗体通过基因工程得到的，具有靶向性强、药物副作用小等优势，目前主要用于肿瘤、免疫系统等疾病的治疗，在临床治疗中有较好的应用前景。从全球的角度看，抗体药物市场份额占整个生物技术药物市场份额的40%左右，并且还在继续增长，抗体药物已经成为生物技术药物最重要的一部分，而抗体药物中单克隆抗体药物更是“明星中的明星”，2010年全球最畅销的10种药物中单克隆抗体药物就占了5席，单体产品市场销售额均突破50亿美元。近年来，单克隆抗体药物销售收入快速增长，全球单克隆抗体制剂销售额超过400亿美元，其中，罗氏（基因泰克）公司是单克隆抗体产品的领军企业，拥有7个上市产品，其中包括阿瓦斯丁、美罗华等重磅产品，其主要单克隆抗体产品的销售额占整个生物技术药物销售额的比例已经超过30%，单克隆抗体药物的发展将是未来生物医药发展的主旋律。
思考题
1.HAT筛选后为什么要克隆化？克隆化的原则是什么？
2.杂交瘤细胞为什么要适时冷冻保存？
3.融合后的杂交瘤不生长一般是什么原因？
4.试述单克隆抗体的制备原理。
5.名词解释：杂交瘤细胞、单克隆抗体。
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