细胞的冷冻与复苏

项目十　MDCK细胞的冷冻与复苏

一、项目背景

在长期的细胞培养过程中可能出现微生物污染或基因型改变等情况，从而导致具有优良特性细胞系的丢失。为防止这些细胞的丢失，细胞可以经快速冷冻并几乎无限期地保存在非常低的温度下，如保存在液氮（-196℃）中。细胞冷冻保存是细胞保存的主要方法之一。利用冷冻保存技术将细胞置于-196℃液氮中保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，在需要的时候再复苏细胞而用于实验。另外，适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到细胞保种的作用。

二、项目目标

（1）掌握动物细胞的冷冻方法；

（2）掌握动物细胞的复苏方法；

（3）学会实验设计与统筹安排，培养学生良好的实验习惯。

三、工作流程

流程一：工作准备

续表

流程二：细胞的冷冻

（1）选择处于对数生长期的MDCK细胞，在冷冻保存前一天最好换液。用0.25%胰蛋白酶消化，制备为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不需消化处理。

（2）将细胞收集于离心管中离心（1000r／min，10min），弃上清液。

（3）沉淀加含保护液的培养液，计数，调整至5×10⁶个／mL左右。

（4）将悬液分至冻存管中，每管1～2mL。

（5）将冻存管管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。

（6）贴上标签，写明细胞种类、冷冻保存日期、代次及冷冻保存支数。

（7）按下列顺序降温：室温→4℃（1h）→-20℃（30min）→低温冰箱（-80℃过夜）或气态氮（过夜）→液氮。

流程三：细胞的复苏

（1）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冻存管爆裂造成伤害。

（2）自液氮或干冰容器中取出冻存管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。

（3）将新鲜培养基置于37℃水浴中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭，移入超净工作台内。

（4）取出冻存管，立即放入37～39℃水浴中快速解冻，轻摇冻存管使细胞悬液在1 min内全部熔化，以70%酒精擦拭冻存管外部，移入超净工作台内。

（5）取出解冻的细胞悬液，缓缓地加入有培养基的培养容器内（稀释比例为1∶10～1∶15），混合均匀，放入CO₂培养箱中培养。

（6）解冻后是否立即去除冷冻保护剂，依细胞种类而异。一般来说，不需要立即去除冷冻保护剂。如果要立即去除，则将解冻的细胞悬液加入含有5～10mL培养基的离心管内，1000r／min离心5min，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO₂培养箱中培养。

（7）若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。

四、工作注意事项

（1）从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冷冻保存，但最好为对数生长期细胞，在冷冻保存前一天最好换一次培养液；

（2）液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30L的液氮能用1～1.5个月；

（3）如使用含DMSO的冷冻保存液，因为DMSO在室温状态易损伤细胞，所以细胞加入冷冻保存液后应尽快放入4℃环境中；

（4）采用“慢冻快熔”的方法能较好地保证细胞存活；

（5）细胞在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冷冻保存一段时间后，最好取出一管细胞复苏培养，检测冷冻保存效果；

（6）冷冻保存细胞悬液一旦熔化，要尽快离心弃去冷冻保护液，防止冷冻保护剂对细胞产生毒性；

（7）在复苏细胞过程中，实验人员应有自我保护意识，避免被液氮冻伤。

五、思考题

（1）冷冻保存液的作用是什么？

（2）在进行细胞冷冻保存的前一天，为何最好换液？

（3）细胞冷冻保存和复苏时保证细胞存活率的注意事项有哪些？