基因的检测和分析

三、基因的检测和分析

核酸分子杂交和聚合酶链反应（PCR）是基因诊断的两大基本技术。

（一）核酸分子杂交

Southern印迹杂交和Northern杂交：用1种或多种限制性内切酶消化基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳按大小分离所得的片段，随后使DNA在原位变性，并从凝胶转移至一固相支持体（通常是硝酸纤维素膜或尼龙膜）上。DNA转移至固相支持体的过程中，各个DNA片段的相对位置保持不变。用放射性核素或生物素等标记的DNA或RNA探针与固着于滤膜上的DNA杂交，经放射自显影或通过颜色改变确定样本中和探针互补的条带。此法可用于分析DNA的结构，如DNA限制性内切酶片段长度多态性分析。在DNA定量比较准确的基础上，通过杂交条带的光密度扫描可以进行粗略的基因定量。图15－1示Southern印迹杂交法用于基因诊断的基本过程。

图15－1　Southern印迹杂交法模式图

应用印迹杂交技术也可检测基因的表达产物RNA及其表达水平，称Northern杂交。（二）聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）

在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸（dNTP）存在的条件下，由耐热DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）在体外酶促合成双链DNA反应。PCR的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分为3步：①变性：通过加热破坏DNA双链之间的氢键，使之解离成单链DNA。②退火：当温度突然降低时，由于模板DNA的分子结构比引物要复杂得多，而且反应体系中引物量大大多于模板DNA，因此引物与其互补的模板DNA在局部形成杂交双链，而模板DNA双链之间复性的机会较少。③延伸：在dNTP底物和Mg^2＋存在的条件下，DNA聚合酶的5′→3′聚合酶活性催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。以上3步为一个循环，每一轮扩增的产物可作为下一轮扩增的模板，所以每一个循环都使模板DNA分子增加2倍。数小时之后，样本DNA分子大量复制，可达200万拷贝。PCR的原理示意参见图15－2。

图15－2　聚合酶链反应（PCR）原理示意图

PCR模拟细胞核内的天然DNA复制过程，在几小时内使目的基因扩增百万倍，显著提高基因诊断的灵敏度，PCR的优势：①简便：样品DNA不需要很纯，不必提取DNA，直接用溶解的白细胞、羊水细胞和绒毛即可进行DNA扩增，这对胎儿的产前诊断更为适宜。②灵敏：0．1μg DNA足够用于PCR，单个卵裂球、单个淋巴细胞、单个精子、口腔黏膜脱落细胞、干血迹和发根、甚至考古所得的古代生物材料等都可作PCR扩增。③快速：分子杂交至少需要数周时间，而PCR可在几天甚至几小时内获得诊断结果。④不需基因探针：由于目的DNA已扩增了上百万倍，通过电泳分离、溴乙啶染色就可在紫外线下直接观察待测基因或片断。

PCR衍生技术有：

（1）锚定PCR（anchored PCR）先用DNA末端转移酶在DNA3′端加上poly（dG）尾，再用锚引物poly（dG）与基因特异引物配对进行PCR。锚定PCR可以扩增序列未知或未全知的核酸片段。

（2）不对称PCR（asymmetric PCR）标准PCR的2种引物浓度相等，产物是双链DNA；不对称PCR的两种引物浓度比为50～100∶1，得到的是单链DNA，可用于DNA测序。

（3）反向PCR（inverse PCR）用于扩增已知DNA片段两侧的未知序列。用已知序列内部没有识别位点的限制性内切酶切割此段DNA，再把它连接成环状，用合适方向的与已知两末端互补的引物即可扩增出未知序列的DNA片段。基因组步移文库即由本法建立。

（4）多重等位基因特异性PCR（multiplex allele－specific amplification，MASPCR）设计一组等位基因特异性引物，并把突变基因和正常基因所不同的那一个或几个碱基设计在引物的3′端，通过适合的组合和调整，使它们组成一个多重等位基因特异性PCR体系。这样通过一次PCR就可以检测到一组不同的突变类型。

（5）巢式PCR（nested PCR）巢式PCR使用两对引物，进行2次PCR反应，第2次PCR的引物位于第1次PCR的扩增范围之内；或者1个引物与第1次的相同，另一个引物位于第1次扩增的范围之内。两次PCR循环条件相同，但第2次反应以第一次的产物为模板。巢式PCR用于扩增极微量的DNA样品。

（6）荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR，FQ－PCR）FQ－PCR在常规PCR的基础上，添加了一条标记2个荧光基因的探针，一个标记在5′端，称为荧光报告基因（R）；另一个标记在探针的3′端，称为荧光抑制基因（Q）。两者可构成能量的传递结构，即5′端荧光基团所发出的荧光可被另一荧光基团吸收或抑制，探针的3′端羟基（—OH）已被去除或封闭，不具有延伸能力。探针在无特异性PCR发生时，荧光信号不改变。当有特异性PCR扩增发生时，探针在PCR过程中被Taq酶的5′→3′活性作用而切断，抑制作用消失，从而引起报告荧光信号的增长，荧光信号伴随着PCR进行，依PCR产物的增长而增长，故在PCR进行过程中，连续不断地测定反应体系中的荧光信号的变化。当信号增强到某一阈值时，循环参数（Ct值）被记录下来，该循环参数与PCR体系中起始的DNA量的对数值之间具有严格的线性关系，利用阳性梯度标准品的Ct值，制成标准曲线，再根据样品的Ct值可以准确地定量起始DNA的数量。