项目一 比色分析法和分光光度法
许多物质本身具有一定的颜色，也有许多物质本身无颜色，在加入适当的显色剂后才生成有色物质。溶液浓度越大，颜色越深。因此，可以利用比较溶液颜色深浅的方法来测定有色溶液的浓度。
一、基本原理
比色分析法是依据比较溶液颜色深浅来测定有色溶液的浓度，并用各种光电比色计及分光光度计完成测定分析的方法，其理论基础符合朗伯－比尔（Lambert－Beer）定律。
二、相关基本概念
1.物质的颜色和波长（λ）
可见光：λ＝400～760nm。
紫外光：λ＜400nm。
红外光：λ＞760nm。
各种颜色光的近似波长列于表2－1。
表2－1 各种颜色光的近似波长
2.单色光
白光通过棱镜后可分解成各种波长不同的色光。具有一种波长且不能再分解的光称为单色光。
3.光的互补
将两种适当颜色的可见光按一定强度比例混合可得到白光，这两种光称为互补光，该现象称为光的互补。各色光的互补关系见图2－1。
图2－1 各色光的互补关系示意图
4.溶液的颜色和光吸收的关系
（1）溶液的颜色是由于不同的有色物质有选择地吸收某种颜色的光而引起的。溶液呈现的颜色是与该溶液主要吸收的光互补的光的颜色。溶液吸收的光越多，呈现的颜色越深。
例如：一束白光通过核黄素溶液，溶液呈黄色。因为蓝色光被吸收，而其他颜色的光均为两两互补，透过光只多余出黄色光，所以核黄素溶液呈黄色。
（2）光吸收曲线：测定同一物质对不同波长光线的吸收程度，以波长为横坐标、光密度为纵坐标作图，所得曲线为光吸收曲线。
5.物质浓度、液层厚度与光吸收的关系（Lambert－Beer定律）
当一束单色光通过溶液后，光被溶液吸收的程度（D）与溶液的浓度（C）、液层的厚度（L）以及入射光的强度（I0）有关。溶液浓度越大，液层越厚，吸收的光就越多，这就是物质（均匀透明固体、液体、气体）对光的吸收定律，即朗伯－比尔（Lambert－Beer）定律。
公式D＝KCL
式中：K为消光系数，K＝D/CL，表示有色溶液在单位浓度和单位厚度时的吸光度。同一溶质，K值相同。
意义：物质对光吸收的程度与该物质的消光系数K、溶液浓度C、液层厚度L呈正比。
根据上述公式可推导出对待测溶液浓度的计算。
（1）标准管法：在同样条件下，先测得标准液和待测液的光密度（D）值，然后计算。
（2）标准曲线法：分析大批待测样品时，采用此法较方便。先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，测出它们的光密度（D）值。在一定浓度范围内，溶液浓度（C）与其光密度（D）之间呈直线关系。以各管D值为纵坐标，C值为横坐标，绘制标准曲线。待测溶液D值测出后，在曲线上查出C值。
（3）标准系数法：得到多次测定标准溶液的光密度后求出平均值，标准系数＝标准液浓度/标准液平均光密度。同法测出待测液的光密度，代入下式：
C＝待测溶液光密度×标准系数
（4）消光系数法：在1%浓度、1cm厚度的溶液中测得K＝E1cm 1%，或1克分子浓度、1cm厚度溶液中测得K＝ξ。
常用于紫外吸收法测定蛋白质、核酸含量，二者分别在280nm和260nm处有最大吸收，其消光系数可查表得到。在同样条件下，测定待测溶液的光密度，带入上式即可求得C。
优点：可直接测定，不需呈色反应，不损失样品，操作简便。
注意事项：选择1cm石英比色杯（玻璃杯在紫外光区会强烈吸收紫外光，不能使用）。
三、比色分析条件的选择
1.波长的选择
原则为“吸收最大，干扰最小”。
例：A、B两种物质，A物质最大吸收峰在a处，B物质在a处也有吸收，对A物质的测定有干扰，故选a处波长进行比色测定以满足以上原则。
2.光密度的选择
D值读数在检流计标尺中部时准确度较高，相对误差最小。一般D＝0.05～1。
3.显色条件的选择
在比色分析中常需要利用空白溶液将仪器的透光率调节为100%，此时D为0。空白溶液仅仅不含被测物质，而其他溶液、试剂和处理条件与被测溶液完全相同。因此，利用空白溶液可消除显色溶液中其他有色物质的干扰，抵消比色杯和试剂对入射光的影响。
四、分光光度计的基本结构
光度计、分光光度计的基本结构（图2－2）都由光源、单色光器、狭缝、吸收杯和检测器系统等部分组成。
图2－2 光度计、分光光度计的基本结构
（一）光源
一个良好的光源要求具备发光强度高、光亮稳定、光谱范围广和使用寿命长等特点。钨灯适用于做波长在340～900nm之间的光源。更先进的分光光度计外加有稳压调控的氢灯（hydrogen lamp）。它适用于做波长为200～360nm的紫外分光分析的光源。
（二）单色光器
分光光度法测定某一物质的光密度需要在某一特定波长下进行。单色光器的作用在于根据需要选择一定波长范围的单色光。在实际工作中欲选择出单个某波长的光线是困难的。所谓单色光是指在此波长有最大发射，而在相邻较长和较短波长范围内的发射能量相对较少。单色光的波长范围愈窄，仪器的敏感度愈高，测量的结果愈可靠。
（三）狭缝
通过单色光器的发射光的强度可能过强也可能过弱而不利于进一步检测。狭缝是由一对隔板在光通路上形成的。通过调节狭缝的大小来调节入射单色光强度并使入射光形成平行光线，以适应检测器的需要。光电比色计的狭缝是固定的，而光度计和分光光度计的狭缝大小是可调的。
（四）吸收杯
吸收杯又称为样品杯（sample cell），是光度测量系统的最重要部分之一。在可见光范围内测量时选用光学玻璃吸收杯，在紫外线范围内测量时要选用石英吸收杯。
（五）检测器系统
硒光电池、光电管或光电倍增管等光电元件常用来作为受光器，它们能将通过吸收杯的光线（I）的能量转变成电能。进一步再用适当的方法测量所产生的电流。
光电比色计用硒光电池为受光器。由于硒光电池的光敏感性低，故它不能检出强度非常弱的光线。并且，对波长在270nm以下和700nm以上的光波不敏感。
较精密的分光光度计都是采用真空光电管或光电倍增管作为受光器的，并采用放大装置以提高敏感度。虽然光谱范围狭窄的单色光的能量比范围宽的弱很多，但这种有放大线路的灵敏检测系统仍可能将其准确地检测出来。
五、几种常用的国产分光光度计
（一）可见光分光光度计
1.721型分光光度计
721型分光光度计是一种采用光电管为受光器的较高级的可见光分光光度计。由稳压电源供电的光源灯发出稳定的白光。光线经反射镜投入狭缝，再经准直镜反射进入棱镜，在棱镜中发生色散后，光线再经铝面反射，其中一部分经原路返回，并穿过狭缝，透过反射镜进入吸收杯。从吸收杯射出的光线再经光门射到光电管上，产生相应的电流，并经电流表指示出相应的刻度值。
操作方法如下。
（1）灵敏度选择钮放在“1”挡（如调不到“0”时，再选用较高的挡）。
（2）转动波长选择钮，选用所需的波长。
（3）接通电源（指示灯亮）。
（4）揭开比色皿暗箱盖，转动“0”位钮，使电表指针对准T＝0处。
（5）将比色杯放入比色杯架上，使空白管对向光路，盖好比色皿暗箱盖，转动“百位钮”调准电表指针使之指向D＝0（T＝100处）。
（6）拉动比色皿座的拉杆，使测定杯进入光路，迅速从电表上读出光密度值，记录。比色完毕后，关上电源开关，取出比色杯，将比色皿暗箱盖盖好，清洗比色皿并控干。
2.722型分光光度计的使用
（1）选择波长。
（2）装液：①装入液体2/3～3/4杯，不可过多或过少；②用擦镜纸擦干外表面液体。
（3）灵敏度：调整后不再动。
（4）将比色杯放入比色杯架上，使空白管对向光路，盖好比色皿暗箱盖，转动“百位钮”调准电表指针使之指向D＝0（T＝100处）。原则：开盖调“T＝0”，关盖调“T＝100”。
（5）拉动比色皿座的拉杆，使测定杯进入光路，迅速从电表上读出光密度值，记录。比色完毕后，关上电源开关，取出比色杯，将比色皿暗箱盖盖好，清洗比色皿并控干。
（二）紫外分光光度计
UV－754型分光光度计是一种可供在紫外到红外区（200～1000nm）测量吸收光谱的较高级分光光度计。此仪器的光学部分与721型分光光度计相类似，但它采用石英棱镜作单色光器，有钨丝灯和氢弧灯两种光源。UV－754型分光光度计的电学部分较为复杂。光电流经过放大线路加以放大后，得到的样品信号变为与透光率呈比例的值。
操作方法如下。
1.测试准备
（1）打开电源开关之前，检查一下试样室是否放置遮光物。
（2）试样槽置于“参考”位置。
（3）接电源开关（如果工作波长在200～360nm时需按氘灯触发按钮）。显示器显示“754”后，数值即清晰显示出来。若显示为100.0，则表示仪器已通过自检程序。
（4）仪器预热30min后开始测试。
2.测试
（1）数值显示为100.0后，稳定2～3s，即可把试样槽置于“样品”位置进行测试。待第一个数据打印完毕后，再可将试样槽置于第二个“样品”位置测试。
（2）每当需要调换波长时，必须把试样槽置于“参考”位置，重新调满度。
3.注意事项
（1）光电比色计属于精密仪器，应精心爱护使用，要防震、防潮、防腐蚀。
（2）仪器预热30min后开始测试。光能量变化急剧，使光电管受光后响应缓慢，需一段光响应平衡时间。
（3）比色杯的好坏对光密度读数的影响很大，要保持比色杯的清洁干净，保护光学面的透明度，不能手握光学面，也不能用粗糙的物体接触光学面，比色杯中的液体应适量，不应过满，比色杯外壁的液体应用擦镜纸擦干，以防腐蚀仪器和影响读数。如比色液为强酸、强碱，应尽快比色，以防破坏比色杯。
（4）比色时间应尽量缩短，以防光电系统疲劳。如需连续使用，中间应适当暂停一下，使之避光休息。
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