度液中沉降速度及沉降系数

项目四　离心技术

离心技术，是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离的最常用的方法之一，也是生物化学实验室中常用的分离、纯化的方法。

一、基本原理

离心技术是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离的目的。常用仪器为离心机。

这里的悬浮颗粒主要指制成悬浮状态的细胞、细胞器、病毒和生物大分子等。当离心机转子高速旋转时，如果悬浮颗粒密度大于周围介质密度时，颗粒离开轴心方向移动，发生沉降；如果悬浮颗粒密度小于周围介质密度时，则颗粒朝向轴心方向移动而发生漂浮。

二、相关基本概念

（一）离心力和相对离心力

溶液中的固相颗粒做圆周运动时产生一个向外离心力，符合公式：

式中：F为离心力的强度；m为沉降颗粒的有效质量；ω为离心转子转动的角速度，单位为rad/s；r为离心半径，即转子中心轴到沉降颗粒之间的距离，单位为cm。

离心力随着转速和颗粒质量的提高而加大，而随着离心半径的减小而变小。离心力通常以相对离心力FRC表示，即离心力F的大小相对于地球引力G的多少倍，单位为g，其计算公式如下：

在同一转速下，由于r的不同，FRC相差会很大，实际应用时一般取平均值。在离心实验的报告中，FRC、r平均、离心时间t和液相介质等条件都应表示出来，因为它们都与样品的沉降速度有直接的联系。显然FRC是一个只与离心机相关的参数，而与样品并无直接的关系。

（二）沉降速度与沉降系数

用离心法时，大分子沉降速度的量度，等于每单位离心场的速度，即s＝v/ω²r。式中，s是沉降系数，其单位为s；ω是离心转子的角速度，单位为弧度/秒；r是到旋转中心的距离；v是沉降速度。沉降系数以每单位重力的沉降时间表示，并且通常为1～200×10^－13s，10^－13这个因子称作沉降单位S，即1S＝10^－13s，为纪念离心机研究先锋Theodor Svedberg，故将该数值命名为1Svedberg单位，简写为S。如血红蛋白的沉降系数约为4×10^－13s或4S。大多数蛋白质和核酸的沉降系数在4S和40S之间，核糖体及其亚基在30S和80S之间，多核糖体在100S以上。

近年来，在生物化学、分子生物学及生物工程等书刊文献中，对于某些大分子化合物，当它们的详细结构和相对分子质量不很清楚时，常常用沉降系数这个概念去描述它们的大小。如核糖体RNA（rRNA）有30S亚基和50S亚基，这里的S就是沉降单位，现在多用于生物大分子的分类，特别是核酸的分类。

三、常用的离心机类型

低速离心机：转速为0～6000r/min。

高速离心机：转速为6000～25000r/min。

超速离心机：转速大于25000r/min。

四、离心方法类型

（一）差速离心法

通过逐步增加相对离心力，使一个非均相混合液内形状不同的大小颗粒分步沉淀。

（二）密度梯度离心法

离心前，离心管内先装入分离介质（如蔗糖、甘油等），使形成连续的或不连续的密度梯度介质，然后加入样品进行离心，具体又可分为以下三种。

1.速度区带离心法

离心前，离心管内先装入蔗糖、甘油、CsCl、Percoll等密度梯度介质，将待分离样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度液中间，同梯度液一起离心，利用各颗粒在梯度液中沉降速度或漂浮速度的不同，使具有不同沉降速度的颗粒处于不同密度的梯度层内，以达到彼此分离的目的。本法可分离各种细胞、病毒、染色体、脂蛋白、DNA和RNA等生物样品。

2.预制梯度等密度离心法

在离心前预先配制管底浓而管顶稀的密度梯度介质，常用介质有蔗糖、CsCl、Cs₂SO₄等，待分离样品一般铺在梯度液顶部，如需夹在梯度液中间或管底部，则需调节样品液密度。离心后，不同密度的样品颗粒到达与自身密度相等的梯度层，即达到等密度的位置而获得分离。

3.自成梯度等密度离心法

某些密度介质经过离心后会自成梯度，如Percoll，可迅速形成梯度，CsCl、Cs₂SO₄和三碘甲酰葡萄糖胺经长时间离心后也可产生稳定的梯度。需要离心分离的样品可和梯度介质先均匀混合，离心开始后，梯度介质由于离心力的作用逐渐形成管底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时，可以带动原来混合的样品颗粒也发生重新分布，到达与自身密度相等的梯度层里，即达到等密度的位置而获得分离。

（三）沉降平衡离心法

根据被分离物质的浮力密度差进行分离，所用的介质起始密度约等于被分离物质的密度，介质在离心过程中形成密度梯度，被分离物质沉降或上浮到达与之密度相等的介质区域中停留，并形成区带。