实验项目一 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳
学习目标
【知识目标】
（1）能够准确描述醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质的原理。
（2）能用自己的语言描述血清中各种蛋白质的成分和相对百分含量。
（3）能够简要描述醋酸纤维素薄膜电泳的内容及操作要点。
【能力目标】
（1）能在规定时间内正确完成实验操作内容，做到步骤正确。
（2）能够学会人及动物血清的制备，并能说出血清与血浆的区别。
（3）能够熟练使用电泳仪、电泳槽。
（4）能够准确判断在什么情况下需要患者进行血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳，说明其能辅助诊断哪些临床疾病。
患者，女，42岁，面色苍白，双腿进行性水肿。临床检查结果：血压正常，肺部听诊有浊音，血清蛋白质电泳图谱中清蛋白区带明显变小、变浅，血清白蛋白降低，α2－球蛋白、β－球蛋白则升高；尿白蛋白（＋）。请初步诊断是什么病？
（提示：肾病综合征）
【实验原理】
醋酸纤维素薄膜电泳是利用醋酸纤维素薄膜做固体支持物的电泳技术。醋酸纤维素薄膜是纤维素的羟基经乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将其溶解在有机溶剂中，并涂成均匀的薄膜，具有均一的泡沫结构，厚度仅120μm。醋酸纤维素薄膜作为电泳支持物具有对各种蛋白质（包括血清白蛋白、核糖核酸酶、溶菌酶等）几乎完全不吸附，同时对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完全无色的优点。醋酸纤维素薄膜电泳与纸电泳相似，且是在其基础上发展起来的。该电泳具有比
案例引导
纸电泳电渗小、分离速度快、样品用量小（可少于10μL），而分辨率高和分离清晰等优点。因此，从1956年Kohn首先应用此法以来，纸电泳已逐渐被其取代。醋酸纤维素薄膜电泳的操作方法除比琼脂电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳简便外，还有一个显著优点，即染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液浸泡透明，透明后的薄膜便于保存和进行定量分析。醋酸纤维素薄膜电泳已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白、多肽、核酸、同工酶及其他生物大分子的分析检测，是医学和临床检验的常规技术。
由于以醋酸纤维素薄膜进行蛋白电泳有诸多优点，故常采用此种方法分离血清蛋白质并加以定量。血清中含有多种蛋白质，在本实验中分离的主要有清蛋白（又称白蛋白）、α1－球蛋白、α2－球蛋白、β－球蛋白、γ－球蛋白。其等电点各不相同，大多在4.64～7.3之间。
蛋白质为两性电解质，在不同pH值条件下，其带电情况不同。在等电点时，蛋白质为兼性离子，其净电荷为零，在电场中不发生泳动；蛋白质分子在pH值小于其等电点的溶液中，呈碱式解离，带正电荷，在电场中向负极泳动；蛋白质分子在pH值大于其等电点的溶液中，呈酸式解离，带负电荷，在电场中向正极泳动。根据Stoke定律，假定带电粒子为球形，带电粒子在电场中的电泳速度用下列公式表示。
式中：Q为带电荷量；E为电场强度；6π为带电粒子的经验半数；r为分子半径；η为黏度系数。
由此可知，带电粒子的泳动速度除与电场强度和溶液性质有关外，主要取决于带电粒子的电荷量以及颗粒的大小与形状。
血清蛋白质种类不同，其分子质量、大小、形状各不相同，等电点也不同。因此，在同一pH值溶液中，可解离成带有不同电荷的离子，而在电场作用下，以不同的电泳速度聚集在不同的位置，在支持介质上呈现出不同的电泳区带，从而实现分离血清中各种不同蛋白质成分的目的。
本实验电泳系统采用的是pH值为8.6的巴比妥缓冲液，该溶液的pH值大于血清中蛋白质的等电点，使得血清蛋白质均带负电荷，在恒定的电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质的等电点不同，分子所带的净电荷（Q）及形状、大小（r）各不相同。因此，在电场中泳动的速度也不同，在相同的时间内，移动的距离不同，在电泳介质上产生不同的电泳区带，故可将其分离。分离后的蛋白质用氨基黑10B染色，漂洗后，醋酸纤维素薄膜上便呈现出不连续的区带即蛋白电泳图谱，从正极端起，分别为清蛋白（白蛋白）、α1－球蛋白、α2－球蛋白、β－球蛋白及γ－球蛋白。由于蛋白质含量与吸附的染料有一定正比关系，据此，剪下各条谱带，用碱液洗下蛋白质吸附的染料，进行比色分析，即可求出血清样品中各区带蛋白质的相对百分比。此外，也可对透明处理过的电泳图谱进行扫描分析，自动绘出区带吸收峰，依据扫描曲线中各区带的面积与总面积之比，亦可计算出各区带蛋白质的百分含量。表3－1列出了几种常见血清蛋白质的等电点及平均相对分子质量。
表3－1 几种常见血清蛋白质的等电点及平均相对分子质量
【实验器材】
电泳仪，电泳槽，醋酸纤维素薄膜（2×8cm2），培养皿，点样器，粗滤纸条，铅笔，直尺，镊子，染色缸，漂洗缸，载玻片。
【药品及试剂】
巴比妥缓冲液（pH＝8.6，离子强度0.6），染色液，漂洗液，洗脱液，透明液，新鲜血清。
【试剂配制】
1.巴比妥缓冲液（pH＝8.6，离子强度0.6）
巴比妥钠12.76g，巴比妥1.66g加蒸馏水数百毫升，加热溶解后再补加蒸馏水至1000mL，混匀。
2染色液
氨基黑10B0.5g，溶于甲醇50mL中，再加冰醋酸10mL、蒸馏水40mL混匀。
3.漂洗液
甲醇（或95%乙醇）45mL，冰醋酸5mL，蒸馏水50mL混匀。
4.洗脱液
0.4mol/L氢氧化钠溶液。
5.透明液
95%乙醇20mL，冰醋酸5mL混匀。
操作流程
【操作步骤】
1.浸膜
用镊子取醋酸纤维素薄膜1张（识别光泽面和粗糙面，并在一角用笔标记），小心平放在盛有巴比妥缓冲液的平皿中，使膜充分浸透下沉，约30min。
2.点样
（1）将充分浸透的膜取出，用干净的两张滤纸吸去多余的缓冲液，醋酸纤维素薄膜粗糙面向上，用铅笔在距左侧边缘一端1.5～2.0cm处画一条点样线（图3－1）。
图3－1 醋酸纤维素薄膜规格及点样线位置示意图
注：虚线处为点样线位置。
（2）用点样器在盛有血清的表面皿中蘸一下，使点样器下端粘上薄层血清，再将点样器轻轻地印在点样线上，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。
3.电泳
醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图如图3－2所示。将点样后的膜置于电泳槽架上，放置时膜暗面（即点样面）向下，点样端置于阴极，槽架上以四层滤纸（或纱布）作桥垫，膜条与滤纸需贴紧，将膜摆平拉直，盖好电泳槽盖平衡5min。
图3－2 醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图
检查电泳槽电极的连接正确无误后通电，调节电流，按总膜宽计算，每厘米宽给电流0.4～0.6mA，通电时间45～60min。
4.染色
通电完毕后，立即用镊子将薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B染色液的染色缸中，浸染5～10min，然后移放漂洗液中漂洗数次，至蛋白条带清晰、本底无色为止，取出薄膜用滤纸吸干。
5.定量
将漂洗干净的膜夹在滤纸中吸干，剪下各蛋白区带及一段平均大小的空白区，分别依次放入试管中，标清管号，向清蛋白管内加入0.4mol/L NaOH 10mL，其余各管加0.4mol/L NaOH 5mL，轻轻振摇，使着色完全洗脱于溶液中，用620nm波长比色，记取各管光密度值。
6.透明
将脱色后的薄膜浸入透明液中，浸泡2～3min后，取出紧贴于洁净载玻片（或玻璃板）上，两者间不能有气泡，干后即为透明的薄膜。
【实验数据处理及结果分析】
1.直观观察
用肉眼观察，在膜上有五条区带出现。从正极端起分别是清蛋白（A）、α1－球蛋白（α1）、α2－球蛋白（α2）、β－球蛋白（β）、γ－球蛋白（γ）。可按染色区带位置进行定性观察，其分析结果如图3－3所示。
图3－3 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳结果定性分析示意图
2.定量分析
（1）计算各组分相对百分比。计算方法如下。
正常参考值（相对百分比）：
清蛋白 57%～72%
α1－球蛋白 2%～5%
α2－球蛋白 4%～9%
β－球蛋白 6.5%～12%
γ－球蛋白 12%～20%
（2）计算出清蛋白与球蛋白之比值（A/G）。
（3）也可以直接用透明后的膜进行光密度扫描法来测定各组分的相对百分比。将干燥的血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱放入自动扫描光密度仪（或色谱扫描仪）内，通过反射（使用未透明的薄膜时）或透射（用已透明的薄膜时）方式，在记录器上自动绘出血清蛋白质各组分曲线图，横坐标为膜的长度，纵坐标为光密度（或光强度），每一个峰代表一种蛋白质组分。然后，用求积仪测量出各峰的面积，计算每个峰的面积与它们总面积的百分比就代表血清中各种蛋白质组分的相对百分比。或将曲线图上各峰沿曲线剪下，称量各峰的重量，计算每个峰的重量与它们总重量的百分比也可以代表血清中各种蛋白质组分的相对百分比。在使用具有电子计算机附件的自动扫描光密度仪时，可以由显示部分或打字带上获得血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱上每条区带所代表的蛋白质组分的含量（图3－4）。
图3－4 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳结果定量分析示意图
【注意事项】
（1）市售的醋酸纤维素薄膜都是干燥的膜片，薄膜是否浸润完全是电泳成败的关键因素。若飘浮于液面的薄膜在15～30s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜制作均匀可用于电泳。醋酸纤维素薄膜在电泳前，一定要用缓冲液充分浸泡。如果条件允许至少要求浸泡2h，过夜更好。
（2）醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH值为8.6巴比妥－巴比妥钠缓冲液，其浓度为0.05～0.09mol/L。选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有关。如果缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，会导致区带扩散变宽；如果缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，会导致区带分布过于集中，不易分辨。此外，多次电泳后，由于水分蒸发，缓冲液的离子强度会发生改变。因此，每次电泳后应交换正、负极两侧的电泳缓冲液，并补足蒸发掉的水量，多次电泳后应换新的缓冲液。
（3）点样时，因为醋酸纤维素薄膜承载蛋白质量有限，加样量不宜过多。应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不齐，从而影响分离效果。
（4）点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。
（5）铺膜时，为防止指纹污染，应戴手套。应注意暗面向下，点样端置于负极侧。因血清蛋白在pH值为8.6的缓冲液中全部带负电荷，电泳时会向正极移动；若点样端误置于正极，经过一定时间电泳后，蛋白质将移出醋酸纤维素薄膜。同时，铺膜时醋酸纤维素薄膜长边应与电力线严格保持平行，两端应分别与正、负极盐桥紧密接触并拉平膜面。
（6）电泳时应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.4～0.6mA/cm膜宽度。电流强度高，则热效应高；电流强度过低，则样品泳动速度慢且易扩散。此外，电泳膜两端电压应控制在120V左右，不能过高。
【实验意义】
（1）正常值：清蛋白（白蛋白）/球蛋白＝（1.5～2.5）∶1。
（2）意义：血清中蛋白质的种类很多，它们大多在肝内合成，但生理功能各不相同。在正常情况下，由肝脏合成的清蛋白（又称白蛋白）、α－球蛋白、β－球蛋白，在血清中的浓度常在一定范围内波动，且A（清蛋白）/G（球蛋白）比值维持在1.5～2.5之间。但在某些病理条件下，血清蛋白的含量常发生改变。因此，血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳在临床上常用于分析血、尿等样品中的蛋白质含量，以供临床上肝、肾等疾病辅助检验参考。
①肾病综合征、急慢性肾炎、肾功能衰竭等患者，血浆蛋白中小分子量的清蛋白漏出且随尿液排出体外，导致醋酸纤维素薄膜电泳图谱中清蛋白区带明显变小、变浅，血液中清蛋白含量降低，而α2－球蛋白、β－球蛋白含量升高。
②急、慢性肝炎和肝硬化患者，由于肝细胞受损，肝脏合成血浆蛋白的能力大大下降，使血浆中的清蛋白含量显著降低，其球蛋白总量则明显升高，β－球蛋白和γ－球蛋白含量增高，故A/G比值下降，甚至可出现清蛋白含量小于球蛋白含量，从而使A/G比值小于1，这种情况称为清/球倒置。肝硬化患者，有时也会出现β－球蛋白和γ－球蛋白难分离而相连的“β～γ桥”，此现象往往是由于IgA增高所致，IgA与肝纤维化有关。
③在多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、重链病患者血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱中可见不正常的球蛋白条带。整个球蛋白条带可分离出6条区带，在β－球蛋白与γ－球蛋白后区段的各部分出现1条致密浓集的条带，为M蛋白带。多发性骨髓瘤在表3－2列出的疾病中可见醋酸纤维素薄膜蛋白电泳图明显异常。
④脐带血清、胎儿血清、部分原发性肝癌患者血清，在清蛋白与α1－球蛋白之间可增加1条甲胎蛋白带。
表3－2 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳条带异常与疾病
能力检测
一、单项选择题
1.正常人血清A/G之比应为（ ）。
A.1.5∶1 B.（1.5～2.5）∶1 C.2.5∶1
D.1∶（1.5～2.5） E.3∶1
2.血清中清蛋白含量下降常见于许多病理情况，但下列哪种情况除外？（ ）
A.手术后 B.肠胃功能紊乱 C.营养不良
D.肾病综合征 E.急性肝炎早期
3.在肾病综合征中，下列哪种蛋白含量可出现升高？（ ）
A.清蛋白 B.α1－球蛋白 C.α2－球蛋白
D.脂蛋白 E.γ－球蛋白
4.下列关于肝硬化患者血清蛋白电泳结果描述不正确的是（ ）。
A.A/G之比为（1.5～2.5）∶1
B.清蛋白含量显著降低，其球蛋白总量则明显升高
C.β－球蛋白和γ－球蛋白含量增高
D.A/G比值小于1，称为清/球倒置
E.有时也会出现β－球蛋白和γ－球蛋白条带相连
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