酶的专一性及影响酶促反应速度的因素

实验二　酶的专一性及影响酶促反应速度的因素

【教学目标】

通过本实验，证明酶对底物催化的专一性，以及pH值、温度、激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响。

【实验原理】

唾液淀粉酶能专一地催化淀粉水解，生成一系列水解产物，即糊精、麦芽糖、葡萄糖等。麦芽糖或葡萄糖都属于还原糖，能使班氏试剂中的二价铜离子（Cu^2＋）还原成亚铜离子，并生成砖红色的氧化亚铜（Cu₂O）。淀粉酶不能催化蔗糖水解，且蔗糖本身不是还原糖，所以不能与班氏试剂作用呈色，也不能以此证明酶催化底物的专一性。

淀粉或淀粉的水解产物遇碘会呈现不同的颜色。淀粉遇碘变蓝色，糊精遇碘则根据其分子量的大小依次呈现紫色、褐色、红色，而麦芽糖、葡萄糖遇碘不呈色。通过颜色变化可以了解淀粉酶在不同条件下水解淀粉的程度，以观察pH值、温度、激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响。

【试剂】

（1）1%淀粉溶液：称取可溶性淀粉1g，加5mL蒸馏水调成糊状，徐徐倒入80 mL煮沸的蒸馏水中，不断搅拌，待其溶解后，加蒸馏水至100mL。此溶液应新鲜配制，以防止细菌污染。

（2）1%蔗糖溶液：称1g蔗糖，加蒸馏水至100mL溶解。

（3）pH 6．8缓冲液：取0．2mol/L磷酸氢二钠溶液154．5mL，与0．1mol/L柠檬酸溶液45．5mL混合即可。

（4）pH 4．8缓冲液：取0．2mol/L磷酸氢二钠溶液98．6mL，与0．1mol/L柠檬酸溶液101．4mL混合即可。

（5）pH 8．0缓冲液：取0．2mol/L磷酸氢二钠溶液194．5mL，与0．1mol/L柠檬酸溶液5．5mL混合即可。

（6）班氏试剂：溶解结晶硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）17．3g于100mL热的蒸馏水中，冷却后加水至150mL，为A溶液。取柠檬酸钠173g和无水碳酸钠100g，加蒸馏水600mL，加热溶解，冷却后加水至850mL，为B溶液。将A溶液缓慢倒入B溶液中，混匀即可。

（7）稀碘液：称取碘1g、碘化钾2g，溶于300mL蒸馏水中。

（8）0．9%NaCl溶液。

（9）0．1%CuSO₄溶液。

（10）0．1%Na₂SO₄溶液。

（11）稀释唾液：用清水漱口，清除食物残渣，再含蒸馏水30mL做咀嚼运动，2 min后将稀释唾液收集于样品杯中备用。

【器材】

试管、试管夹、样品杯、滴瓶、温度计、恒温水浴箱、煮沸水浴箱、冰箱等。

【操作】

（1）酶的专一性：取两支试管，编号，按实验表2－1操作。

实验表2－1　酶的专一性

（2）pH值对酶促反应速度的影响：取三支试管，编号，按实验表2－2操作。

实验表2－2　pH值对酶促反应速度的影响

（3）温度对酶促反应速度的影响：取三支试管，编号，按实验表2－3操作。

实验表2－3　温度对酶促反应速度的影响

（4）激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响：取四支试管，编号，按实验表2－4操作。

实验表2－4　激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响

【注意事项】

（1）唾液淀粉酶的活性存在个体差异，同时受唾液稀释倍数影响，收集唾液时应事先确定稀释倍数，或收集2～4个人的混合唾液。

（2）酶促反应的保温时间将直接影响本实验的结果。根据各实验室条件通过预试，确定最佳保温时间。

【思考题】

结合本实验说明pH值、温度、激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响。

（沈建林）