葡萄糖测定（葡萄糖氧化酶法

实验三　血清（浆）葡萄糖测定（葡萄糖氧化酶法）

【教学目标】

（1）了解葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖的原理。

（2）掌握血清葡萄糖测定的操作技术及临床意义。

【实验原理】

葡萄糖氧化酶（GOD）能催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并释放出过氧化氢。生成的过氧化氢在过氧化物酶（POD）的催化下，分解为水和氧，并使色原性氧受体4－氨基安替比林和酚缩合为红色醌类化合物，即Trinder反应。红色醌类化合物的生成量与葡萄糖含量呈正比。

【试剂】

（1）0．1mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7．0）：称取无水磷酸氢二钠8．67g及无水磷酸二氢钾5．3g溶于800mL蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠（或1mol/L盐酸）将溶液pH值调至7．0，用蒸馏水定容至1L。

（2）酶试剂：称取过氧化物酶1200U、葡萄糖氧化酶1200U、4－氨基安替比林10 mg、叠氮钠100mg，溶于磷酸盐缓冲液80mL中，用1mol/L NaOH将溶液pH值调至7．0，用磷酸盐缓冲液定容至100mL。最后，置于4℃中保存，可稳定3个月。

（3）酚溶液：称取重蒸馏酚100mg溶于蒸馏水100mL中，用棕色瓶储存。

（4）酶酚混合试剂：酶试剂及酚溶液等量混合，在4℃中可以存放1个月。

（5）12mmol/L苯甲酸溶液：溶解苯甲酸1．4g于约800mL蒸馏水中，加温助溶，冷却后加蒸馏水定容至1L。

（6）100mmol/L葡萄糖标准储存液：称取已干燥恒重的无水葡萄糖1．802g，溶于12mmol/L苯甲酸溶液约70mL中，以12mmol/L苯甲酸溶液定容至100mL。2h以后方可使用。

（7）5mmol/L葡萄糖标准应用液：吸取葡萄糖标准储存液5．0mL置于100mL容量瓶中，用12mmol/L苯甲酸溶液稀释至需要刻度，混匀。

【器材】

半自动生化分析仪或721型分光光度计；试管、吸管、试管架、水浴箱、加样器。

【操作】

（1）自动分析法：按仪器说明书的要求进行测定。

（2）手工操作法：取试管三支，按实验表3－1操作。

实验表3－1　葡萄糖氧化酶法测血清葡萄糖操作步骤

续表

混匀，置于37℃水浴箱中，保温15min，在波长505nm处比色，以空白管调零，读取标准管及测定管吸光度。

【计算】

【参考范围】

空腹时血清葡萄糖含量为3．89～6．11mmol/L。

【临床意义】

（1）生理性高血糖症可见于摄入高糖食物后，或情绪紧张肾上腺分泌增加时。

（2）病理性高血糖症：

①糖尿病：病理性高血糖症常见于胰岛素绝对或相对不足的糖尿病患者。

②内分泌腺功能障碍：常见于甲状腺功能亢进、肾上腺皮质功能及髓质功能亢进。因此而引起的各种对抗胰岛素的激素分泌过多也会出现高血糖症。注意，升高血糖的激素增多引起的高血糖症，现已归入特异性糖尿病中。

③颅内压增高：颅内压增高刺激血糖中枢，如颅外伤、颅内出血、脑膜炎等。

④脱水引起的高血糖症：如呕吐、腹泻和高热等也可使血糖浓度轻度升高。

（3）生理性低血糖症：常见于饥饿和剧烈运动时。

（4）病理性低血糖症（特发性功能性低血糖症最多见，依次是药源性低血糖症、肝源性低血糖症、胰岛素瘤等）。

①胰岛β细胞增生或胰岛β细胞瘤等，使胰岛素分泌过多。

②对抗胰岛素的激素分泌不足，如垂体前叶功能减退、肾上腺皮质功能减退和甲状腺功能减退而使生长素、肾上腺皮质激素分泌减少。

③严重肝病患者，由于肝脏储存糖原及糖异生等功能低下，肝脏不能有效地调节血糖浓度。

【注意事项】

（1）葡萄糖氧化酶法可直接测定脑脊液葡萄糖含量，但不能直接测定尿液葡萄糖含量。因为尿液中的尿酸等干扰物质浓度过高，可干扰过氧化物酶反应，造成结果假性偏低。

（2）测定标本以草酸钾－氟化钠为抗凝剂的血浆较好。取草酸钾6g，氟化钠4g。加水溶解至100mL。吸取0．1mL到试管内，在80℃以下烤干使用，可使2～3mL血液在3～4d内不凝固，并能抑制糖分解。

（3）本法样品、标准用量甚微。加样器的使用要规范，应注意标本及标准移液量要准确，以保证结果可靠。

（4）严重黄疸、溶血及乳糜样血清应先制备无蛋白血滤液，然后再进行测定。

（5）本法第一步是特异反应，第二步特异性较差。误差往往发生在反应的第二步。一些还原性物质如尿酸、维生素C、胆红素和谷胱甘肽等，可与色原性物质竞争过氧化氢，从而消耗反应过程中所产生的过氧化氢，使测定结果偏低。

【思考题】

（1）血糖样品为什么要求立即检测或及时分离血清？

（2）测定血糖时，以草酸钾－氟化钠为抗凝剂的血浆样品为什么较其他抗凝剂的血浆样品好？

（王易振）