血清丙氨酸氨基转移酶测定（赖氏法）

实验六　血清丙氨酸氨基转移酶测定（赖氏法）

【教学目标】

了解赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）的基本原理，掌握血清丙氨酸氨基转移酶的实验方法及临床意义。

【实验原理】

丙氨酸氨基转移酶催化丙氨酸与α－酮戊二酸间的氨基转移反应，生成丙酮酸和谷氨酸。

生成的丙酮酸再与2，4－二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙。后者在碱性条件下呈红棕色。其颜色深浅与酶活性呈正比，与同样处理的丙酮酸标准液比色即可测得血清ALT的活性。

【试剂】

（1）0．1mol/L磷酸二氢钾溶液：称取KH₂PO₄13．61g，溶解于蒸馏水中，并用蒸馏水定容至1L，于4℃条件下保存。

（2）0．1mol/L磷酸氢二钠溶液：称取Na₂HPO₄14．22g，溶解于蒸馏水中，并用蒸馏水定容至1L，于4℃条件下保存。

（3）0．1mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 7．4）：取420mL 0．1mol/L磷酸氢二钠溶液与80mL 0．1mol/L磷酸二氢钾溶液混匀。加三氯甲烷数滴，于4℃条件下保存。

（4）ALT底物缓冲液：精确称取D－L－丙氨酸1．79g和α－酮戊二酸29．2mg，先溶于0．1mol/L的磷酸盐缓冲液约50mL中，再用1．0mol/L的NaOH调pH值至7．4，再加磷酸盐缓冲液至100mL，配制成200mmol/L丙氨酸与2．0mmol/Lα－酮戊二酸底物缓冲液，4～6℃保存，可稳定两周。每升底物缓冲液可加入麝香草酚0．9g或加三氯甲烷防腐，于4℃条件下保存。

（5）1．0mmol/L 2，4－二硝基苯肼溶液：称取2，4－二硝基苯肼（分析纯）19．8g，溶于1．0mol/L的100mL盐酸中，室温，保存于棕色瓶内。如有结晶析出，需重新配制。

（6）0．4mol/L的NaOH溶液：准确称取NaOH 1．6g溶解于蒸馏水中，并继续加蒸馏水定容至100mL，置于塑料瓶内，室温下可长期保存。

（7）2．0mmol/L丙酮酸标准液：准确称取丙酮酸钠（分析纯）22．0mg，用少量0．05mol/L硫酸溶解并定容至100mL，此液应新鲜配制。

【器材】

试管、试管架、吸管、加样器、恒温水浴箱、721型分光光度计。

【操作】

取试管三支，按实验表6－1操作。

实验表6－1　血清丙氨酸氨基转移酶（赖氏法）测定操作步骤

各管混匀，置于37℃恒温水浴箱中20min，分别加入NaOH溶液（0．4mol/L）5 mL；放置3～5min后以空白管调零，在505nm波长下比色，读取各管吸光度。

【计算】

注：按表操作，标准管中丙酮酸和α－酮戊二酸的量与2，4－二硝基苯肼反应所显颜色相当于57个卡门氏单位。

【临床意义】

参考正常值：5～25个卡门氏单位。

正常情况下，ALT存在于机体的各种组织中，以肝脏含量最高，而血清中活性最低。当肝细胞坏死细胞膜破裂或某些原因使细胞膜通透性增加时，酶大量释放入血，血清中ALT活性明显升高，所以在临床上测定此酶的活性有助于肝病的诊断，也可作为观察疗效和预后的指标之一。

【注意事项】

（1）当ALT底物液出现混浊时，停止使用。

（2）NaOH加入速度要求一致，避免由于加入速度不一致造成吸光度差异。

（3）使用电器要注意安全。

（4）一支吸管或一个塑料吸头只能固定移取一种溶液，不能混吸，否则会导致较大误差。

【思考题】

实验过程中有两次置于37℃恒温水浴箱中，其目的各是什么？其中哪一次保温对实验结果的准确性影响最大？

（田　野）